手性环氧氯丙烷(ECH)是一种非常重要的的三碳手性药物合成中间体,用于合成降血脂类药物阿托伐他汀、芳氧丙胺醇类β-肾上腺素阻断剂、减肥药左旋肉碱和抗生素海藻唑啉等多种药物,在医药、农药和精细化工等领域有着广泛的应用。由于目前生物柴油副产物甘油的大量增加,甘油价格大幅度降低,将甘油转化为手性ECH工艺成为未来甘油生物炼制的主要发展方向之一。手性ECH的制备方法主要有化学法和生物法。生物法由于其具有立体选择性高、酶源广泛、生产成本低及环境友好等优点,已成为当前不对称制备手性ECH的重要方法之一。酶法拆分主要包括环氧化物水解酶和卤醇脱卤酶不对称拆分外消旋ECH。生物催化1,3-二氯-2-丙醇(1,3-DCP)的不对称脱卤因其理论收率达100%,是绿色高效制备手性ECH的优先途径。本文以制备手性ECH这一重要平台化合物为目标,着眼于挖掘和分子改造新型卤醇脱卤酶和环氧化物水解酶。本文通过传统土壤筛选、基因组狩猎和数据库挖掘等方法获得了7个卤醇脱卤酶,在大肠杆菌中过量表达,筛选出四种催化性能较优的卤醇脱卤酶。确定4种卤醇脱卤酶最适反应温度为40-50?C,最适pH为10.0。4种卤醇脱卤酶底物谱广,不仅能催化潜手性卤代醇不对称脱卤制备手性环氧化物,还可以不对称拆分外消旋卤代醇制备手性环氧化物。HHDHIs和HHDHTm对4-氯-3-羟基丁酸乙酯(CHBE)也表现出较高的催化活性。在p H 10.0条件下,20-100 mM底物浓度范围内,hhdhsg催化1,3-dcp制备(s)-ech的立体选择性最高,(s)-ech的对映体过量值(ee)和收率在83.4-84.9%和56.2-85.9%之间。而hhdhis表现出相反的选择性,产物(r)-ech的ee值和收率在30.2-58.6%和38.9-73.5%之间。利用卤醇脱卤酶催化(s)-chbe合成(r)-hn,50g/lhhdhtm湿细胞催化100g/l(s)-chbe的转化率和收率分别达到92.8%和89.2%。10g/lhhdhis湿细胞催化150g/l(s)-chbe的转化率和收率分别达到95.4%和90.4%;65g/lhhdhis湿细胞催化300g/l(s)-chbe的转化率和收率分别达到94.5%和89.3%。以拆分ech合成(s)-ech为目标,采用两种策略从实验室筛选保藏的2株菌株中克隆得到3个r-环氧化物水解酶基因,并将3种环氧化物水解酶基因在大肠杆菌中进行异源表达,筛选获得对映体选择性最优的环氧化物水解酶ameh。利用亲和层析技术分离纯化ameh获得纯酶,对其酶学性质进行表征,其最适温度35°c,最适ph8.0。ameh具有较广的底物谱,对多种环氧化物表现出催化活性和较好的立体选择性,取代基的类型、大小和位置影响酶的酶活和立体选择性。ameh对ech表现出良好的立体选择性(e=12.9),在64mm的底物浓度下,(s)-ech的收率和ee值分别达到21.5%和>99%。利用定点突变技术对卤醇脱卤酶进行理性或半理性分子改造研究。通过构建定点饱和突变文库,并利用ph指示剂显色结合手性gc分析,从中筛选获得hhec立体选择性提高的最优突变体p175s/w249p,在ph8.0条件下,其催化1,3-dcp合成(s)-ech的ee值从5.2%提高到95.3%;hhdhsg的最优突变体为v137i,其催化1,3-dcp合成(s)-ech的ee值从84.6%提高到91.8%;对hhdhtm进行分子改造,筛选获得突变体为n183l,催化合成(s)-ech的ee值从40.2%提高到70.2%。通过同源建模和分子对接分析了突变体产物ee值提高的机理,即在活性催化中心,氧负离子亲核进攻被氯取代的2个碳原子的空间位阻大小不同,导致生成的S-构型和R-构型的生成量不等,空间阻力大小相差越大,产物的ee值就越高。卤醇脱卤酶突变体用于催化合成手性ECH,在pH 10.0条件下,20-100 mM底物浓度范围内,突变体P175S/W249P催化合成的产物ee和收率分别在90.4-92.7%和58.0-91.4%之间。突变体V137I催化合成的产物ee和收率分别在87.2-91.5%和48.2-90.7%之间。利用同源建模和分子对接等技术,分析可能影响AmEH立体选择性的氨基酸残基,确定突变位点。结合基于ECH的96孔板高通量筛选模型及手性GC分析的策略,筛选定点饱和突变文库。筛选获得最优突变体W182F/S207V/N240D,其酶活及对映体选择率是原始酶的约1.7和7.0倍。对突变前后对映选择性提高的机理进行分析,结果表明:突变体亲核进攻天冬氨酸中的氧原子与被进攻的两个构型碳原子之间的距离差值越大,环氧化物水解酶的对映选择性越高。最优突变体的△d从原始酶的0.3?提高到1.1?。最优突变体催化75-450mM ECH,获得的(S)-ECH的ee>99%,收率在45.8%-40.5%之间。为提高手性ECH的ee值,利用分子生物学手段成功构建卤醇脱卤酶和环氧化物水解酶在大肠杆菌中的双酶共表达偶联和双酶单表达偶联系统,并成功应用于合成手性ECH。在探究双酶游离细胞偶联催化性能的基础上,对卤醇脱卤酶和环氧化物水解酶进行初步固定化探索,实现双酶偶联连续化操作,显示出良好的合成手性环氧化物和卤代醇的应用潜力。