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肝纤维化是肝脏对慢性损伤的一种修复反应，肝星状细胞(hepaticstellate cells， HSC)活化是肝纤维化形成的中心环节。Saile等[1]认为HSC活化后很难将其由活化逆转为静息状态，主要通过诱导HSC凋亡可使其数量减少，从而逆转肝纤维化。肝星状细胞已成为肝脏纤维化机制及抗肝脏纤维化研究的热点。斑蝥是斑芫青属(Mylabris)昆虫的俗称，斑蝥素(cantharidin CA)是一种半帖烯毒素，是斑蝥抗肿瘤的有效成份；去甲斑蝥素（Norcantharidin NCTD）是斑蝥素的衍生物，由马来酸与呋喃按Diels-Alder人工合成的[2]。大量体外实验研究表明NCTD可诱导HL60、K562、BEL-7402等肿瘤细胞凋亡[3]，NCTD还具有抗器官组织纤维化作用，文献报道其能够延缓肾间质纤维化[4-6]。但NCTD在肝脏纤维化的研究，国内外尚未报道。本实验通过观察NCTD对大鼠的肝星状细胞形态、增殖及凋亡的变化，探讨NCTD对肝星状细胞增殖、凋亡的影响及其可能的机制，为今后NCTD在肝脏纤维化方面的治疗提供临床依据。
目的：本实验主要通过不同浓度的NCTD干预体外培养的大鼠肝星状细胞，研究其对活化的肝星状细胞增殖、凋亡及周期的影响；以及对肝星状细胞线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential，MMP)、Caspase3活性的影响。
方法：应用MTT法检测NCTD对活化的肝星状细胞增殖的影响；Hoechst33342染色普通电子显微镜及荧光显微镜下观察细胞凋亡形态学变化；流式检测细胞凋亡率及周期；JC-1染色流式及激光共聚焦显微镜检测细胞线粒体膜电位；酶标仪检测Caspase3酶活性。
结果：
1 NCTD对HSCs增殖的影响：MTT法检测细胞增殖显示，不同浓度（0.625μg/ml、1.25μg/ml、2.5μg/ml、5.0μg/ml、10.0μg/ml）的去甲斑蝥素分别作用12h、24h、36h与对照组相比A490值明显降低，12h(0.876±0.02、0.855±0.01、0.819±0.02、0.745±0.02、0.638±0.02vs0.949±0.03，P＜0.05)，24h(1.068±0.02、1.007±0.02、0.949±0.03、0.881±0.02、0.633±0.02vs1.148±0.01，P＜0.05)，36h(1.238±0.02、1.023±0.01、0.958±0.02、0.697±0.02、0.567±0.01vs1.337±0.02，P＜0.05)，总体均数差异有统计学意义，不同时间对活化的肝星状细胞增殖有抑制作用，且存在一定的剂量与时间依赖性。抑制率同样具有时间与剂量依赖性，12h（6.99％±3.77％、9.85％±3.41％、13.66％±3.02％、21.53％±2.67％、32.73％±3.72％）；24h（6.96％±2.01％、12.64％±2.12％、17.36％±2.92％、23.25％±1.41％、44.85％±1.71％）：36h(7.37％±1.64％、23.43％±2.29％、28.44％±2.88％、48.04％±2.85％、57.74％±1.66％)，12h后开始抑制HSCs增殖，36h抑制作用明显增强。
2 去甲斑蝥素对HSCs凋亡的影响：
①普通电子显微镜及Hoechest33342染色荧光显微镜下检测细胞凋亡形态显示：NCTD干预HSCs后，细胞核浓缩、凋亡小体出现，说明NCTD可诱导活化的肝星状细胞凋亡，5.0μg/mlNCTD作用12h、24h、36h细胞凋亡率（5.31％±0.29％、18.08％±0.15％、25.45％±0.51％）升高，与空白对照组（2.72％±0.25％）相比有统计学差异(P＜0.05)。
②流式细胞仪检测细胞周期及凋亡率结果示：NCTD（1.25μg/ml、2.5μg/ml、5.0μg/ml）干预HSCs36h后对细胞周期的影响显示：与对照组相比，G2/M期细胞数所占比例逐渐增多(19.00％±0.56％、23.03％±0.35％、33.33％±0.72％vs15.97％±0.45％，P＜0.05)，S期细胞呈现下降的趋势(30.76％±0.93％、28.80％±1.15％、27.73％±1.20％vs42.17％±2.00％，P＜0.05)：而细胞凋亡率（8.03％±0.50％、16.10％±1.05％、25.63％±1.12％）随药物浓度升高逐渐增高，与对照组(5.23％±0.83％）相比，有显著的统计学差异（P＜0.05）；当加入Ac-EDVE-CHO后，细胞凋亡率（19.60％±0.70％）较5.0μg/ml组（25.63％±1.12％）有所下降(P＜0.05)。
③JC-1试剂盒流式细胞仪法检测细胞的早期凋亡线粒体膜电位改变结果示：5.0μg/ml去甲斑蝥素组分别作用于HSCs6h、12h、24h与阴性对照组相比线粒体膜电位均降低（0.891±0.057、0.591±0.010、0.714±0.016）较阴性对照组（1.872±0.019）相比，均有统计学差异（P＜0.05）。5.0μg/ml去甲斑蝥素组分别作用于HSCs12h在激光共聚焦显微镜下观察结果显示药物干预组0.016±0.004）、阳性对照组（0.795±0.061）较阴性对照组(1.161±0.077)相比有显著性差异（P＜0.05）。
④Caspase3活性检测显示：5.0μg/ml的去甲斑蝥素作用活化的肝星状细胞6h、12h、24h、36h后，Caspase3活性（0.657±0.033、0.785±0.037、1.771±0.177、4.806±0.15）较对照组（0.325±0.015）相比明显升高，加入Ac-EDVE-CHO后（2.763±0.152）较去甲斑蝥素36h组有所下降，Caspase3活性总体差异显著有统计学意义(P＜0.05)，说明去甲斑蝥素可影响Caspase3活性。
结论：
①体外细胞培养研究表明，去甲斑蝥素可抑制活化HSCs的增殖，其抑制作用具有一定时间和剂量依赖性。
②去甲斑蝥素可使活化的HSCs凋亡，可影响细胞周期，并使细胞生长阻滞于G2/M期。
③去甲斑蝥素通过线粒体膜电位下降，激活Caspase3酶，促进细胞凋亡。