背景动脉粥样硬化斑块不稳定导致斑块破裂、血栓形成和血管阻塞是引起急性心血管事件发生的重要原因。研究促使动脉粥样硬化斑块稳定性增加的因素对于预防急性心血管事件具有十分重要的意义。近年来,细胞外基质代谢在动脉粥样硬化斑块发生、发展中的作用逐渐得到重视。特别是胶原-动脉粥样硬化斑块纤维帽的主要组成成分是决定斑块稳定性的重要因素之一。胶原的代谢平衡主要通过合成和降解来实现,目前关于胶原降解研究很多,但是关于胶原合成与斑块稳定性的关系尚缺乏研究。胶原合成过程受基因转录水平,翻译水平和翻译后修饰等调节,其中翻译后修饰具有重要作用。脯氨酰4-羟化酶(P4H)是重要的修饰酶,由a和B亚基组成,其中α亚基是限速酶,对胶原的合成和分泌至关重要,它可以把前胶原多肽链折叠成稳定的三倍螺旋状分子。抑制脯氨酰4-羟化酶可导致胶原水平降低并产生不稳定胶原。TNF-α,TGFp和白介素等多种细胞因子都可以调控脯氨酰4-羟化酶活性。脂联素作为脂肪细胞特异的血浆蛋白具有抗炎活性并与代谢综合征和心血管疾病密切相关。既往研究发现脂联素能够对抗导致动脉粥样硬化斑块易损性的多种因素,包括炎症、氧化应激和细胞外基质代谢等。研究表明：循环血中脂联素水平升高和Ⅰ型胶原水平升高成正相关。但是,脂联素通过影响胶原修饰酶活性调控胶原合成的研究目前尚未见报道。基于以上问题,构成了本研究的思路。本研究拟通过观察脂联素过表达与动脉粥样硬化斑块稳定性的关系评价脂联素对脯氨酰4-羟化酶表达及其对动脉粥样硬化斑块作用的效应和机制。研究目的：1.观察脂联素与动脉粥样硬化斑块稳定性的关系。2.观察脂联素与动脉粥样硬化斑块中胶原合成酶P4Hα1及胶原变化的关系。材料和方法1.动物模型建立：120只12周龄,25-30g的雄性apoE小鼠实验全程高脂饮食(含0.25%胆固醇和15%脂肪)喂养。颈动脉套管和基因转染：通过左总颈动脉套管的方法构建动脉粥样硬化斑块动物模型。套管6周后,120只老鼠随机分为PBS组,空病毒转染组和脂联素腺病毒转染组,每组40只。PBS组的apoE小鼠尾静脉注射0.1 ml PBS,空病毒组的apoE小鼠尾静脉注射含2×108 pfu的0.1 ml的绿色荧光蛋白腺病毒载体悬液,脂联素腺病毒转染组的apoE小鼠尾静脉注射含2×108pfu的0.1 ml的脂联素腺病毒载体悬液。2.显微超声检测：使用显微超声影像系统Vevo770于转染前探测未套管侧和左套管侧颈总动脉动脉粥样硬化斑块的基线超声参数。3.血液生化指标检测：转染前和处死前分别取血检测血糖,血胰岛素,总胆固醇,高密度脂蛋白,甘油三酯,低密度脂蛋白和血浆脂联素水平。4.病理学检测：颈动脉斑块组织学切片分别行苏木素一伊红染色、天狼猩红染色、油红O染色、Perl’s染色,并进行免疫组织化学染色观察巨噬细胞(MOMA-2)、平滑肌肌动蛋白(α-SM-actin)、P4Hα1、胶原Ⅰ和Ⅲ的局部表达。使用图像分析软件(Image-Pro Plus 5.0 software)测量斑块面积、纤维帽面积、脂质核面积、纤维帽厚度和内中膜厚度。斑块形态学分级：结合染色结果,根据Virmanis classification criteria,将斑块进行分级。①纤维样病变,②粥样瘤,③薄纤维帽的纤维粥样瘤,④破裂后愈合,⑤破裂或斑块内出血,⑥斑块糜烂。其中1级、2级认为是稳定斑块,3-6级认为是不稳定斑块。5.实时定量RT-PCR：实时荧光定量RT—PCR反应检测斑块内P4Hα1 mRNA的表达水平。6.免疫印迹(Westenr blot)检测：免疫印迹(Westenr blot)检测斑块内P4Hα1,胶原Ⅰ和胶原Ⅲ的蛋白质水平。结果：1.转染前后各组小鼠间体重,血糖,血胰岛素和血脂水平比较转染前后各组小鼠间体重,血糖,血胰岛素,总胆固醇,高密度脂蛋白,甘油三酯和低密度脂蛋白的差异没有统计学意义(P>0.05)。2.动脉粥样硬化斑块的鉴定和转染效率的检测套管6周后,显微超声检测显示套管侧的颈动脉有明显的斑块形成,未套管侧颈动脉管腔光滑。斑块形态和组成的组织学分析结果也表明套管6周后动脉粥样硬化斑块形成,可以在此基础上进行腺病毒转染。转染后较转染前比较血浆脂联素浓度大约升高3倍(12.7±0.6 vs 4.4±0.8μg／mL,P<0.05),差异有统计学意义；转染后,脂联素腺病毒载体转染组的血浆脂联素浓度大约是空病毒载体转染组的2倍(12.7±0.6 vs 6.3±0.8μg／mL,P<0.05),差异有统计学意义；空病毒载体转染组的血浆脂联素浓度与PBS组比较(4.3±0.5 vs 6.3±0.8μg／mL,P>0.05)差异无统计学意义。腺病毒载体转染3天后颈动脉动脉粥样硬化斑块内可见明显GFP表达,斑块内GFP表达量为60%,证实体内转染有效。3.脂联素对动脉粥样硬化斑块稳定性和组成的影响(1)脂联素腺病毒载体转染组小鼠较空病毒载体转染组小鼠比较有较低的不稳定斑块发生率(15%vs.70%,P<0.05),空病毒载体转染组与PBS组比较(65%vs.70%,P>0.05)差异无统计学意义。脂联素腺病毒载体转染组和空病毒载体转染组均未见斑块破裂后愈合,PBS组1／20例(5%)的斑块发生斑块破裂后愈合；脂联素腺病毒载体转染组未见斑块破裂,空病毒载体转染组4／20例(20%)发生斑块破裂,PBS组2／20例(10%)的斑块发生破裂；脂联素腺病毒载体转染组或空病毒载体转染组均未见斑块内出血,PBS组1／20例(5%)发生斑块内出血。(2)脂联素腺病毒载体转染组与空病毒载体转染组比较斑块内巨噬细胞含量(0.07±0.01 vs.0.17±0.01,P<0.05)和脂质含量(0.11±0.02 vs.0.35±0.02,P<0.05)均显著降低,斑块内平滑肌细胞含量(0.43±0.11 vs.0.26±0.03,P<0.05)和胶原含量(0.39±0.08 vs.0.22±0.03,P<0.05)均较空病毒载体转染组增高；空病毒载体转染组与PBS组比较斑块内巨噬细胞、脂质、平滑肌细胞和胶原含量差异均无统计学意义(P>0.05)。脂联素腺病毒载体转染组斑块的易损指数为0.22±0.15,显著低于空病毒载体转染组(0.22±0.15 vs.1.08±0.5,P<0.05)与PBS组(0.22±0.15 vs.0.96±0.42,P<0.05),两对照组比较,差异无统计学意义(0.96±0.42 vs.1.08±0.5,P>0.05)。(3)脂联素腺病毒载体转染组的平均纤维帽厚度(16.5±1.1 vs.8.7+2.6μm,P<0.05),纤维帽面积(7680±460 vs.4210±530μm2,P<0.05)和帽／核比值(0.16±0.02vs.0.09±0.01,P<0.05)均较空病毒载体转染组显著增高。然而,两对照组比较,平均纤维帽厚度(8.9±2.3 vs 8.7±2.6μm,P>0.05),纤维帽面积(4280±490 vs.4210-530μm2,P>0.05)和帽／核比值(0.10±0.02 vs.0.09±0.01,P>0.05)的差异无统计学意义。三组比较,斑块面积、内中膜厚度的差异均无统计学意义(P>0.05)。另外,血浆脂联素水平和内膜胶原比例成正相关(r=0.45,P<0.05)。4.脂联素过表达对P4Hα1表达和胶原含量的影响(1)与空病毒载体转染组相比,脂联素腺病毒载体转染能显著增加斑块内的P4Hα1的mRNA和蛋白表达(P<0.05),两对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。另外,血浆脂联素水平和内膜P4Hα1含量成正相关(r=0.32,P<0.05)。(2)组织学和蛋白印记分析结果均表明：与空病毒载体转染组相比,脂联素腺病毒载体转染能显著增加斑块内的Ⅰ和Ⅲ型胶原水平(P<0.05),两对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。创新性与限制性：创新性(1)通过构建脂联素腺病毒载体使脂联素过表达,然后将脂联素腺病毒载体转染入动脉粥样硬化斑块内,首次探讨了脂联素通过影响胶原合成代谢而发挥稳定动脉粥样硬化斑块的作用。(2)首次研究了脂联素与动脉粥样硬化斑块内脯氨酰4-羟化酶和胶原合成的关系,对于促使动脉粥样硬化斑块稳定性增加具有重要意义。限制性(1)我们只研究了脂联素对颈动脉粥样硬化斑块而没有对全身所有的动脉粥样硬化斑块进行研究。(2)我们只从脂联素影响动脉粥样硬化斑块内胶原合成方面而没有从胶原降解方面进行研究。结论：1.脂联素过表达能显著增加动脉粥样硬化斑块内平滑肌细胞及胶原的表达,平均纤维帽厚度、纤维帽面积和帽-核比值明显增加,同时动脉粥样硬化斑块内巨噬细胞和脂质的含量显著降低,从而使动脉粥样硬化斑块纤维帽增厚,易损性降低,稳定性显著增加。2.脂联素过表达能显著增加动脉粥样硬化斑块P4Hα1表达,从而导致动脉粥样硬化斑块内胶原含量明显增加,斑块纤维帽增厚,斑块稳定性增加。背景急性心血管事件发病的主要原因是动脉粥样硬化斑块不稳定,斑块易于破裂继之血栓形成。细胞外基质成分特别是胶原被认为是影响动脉粥样硬化斑块进程和斑块破裂的重要因素之一。因此,研究胶原代谢和动脉粥样硬化斑块稳定性的关系,明确影响动脉粥样硬化斑块稳定性发生的分子生物学机制对于防止心血管事件的发生具有十分重要的意义。近年来,细胞外基质代谢在动脉粥样硬化发生、发展中的作用逐渐得到重视。胶原的代谢平衡主要通过胶原合成与降解来实现,目前关于胶原降解研究很多,但是关于胶原合成与斑块稳定性的关系尚缺乏研究。胶原合成过程受基因转录水平,翻译水平和翻译后修饰等调节,其中翻译后修饰具有重要作用。脯氨酰4-羟化酶(P4H)是重要的修饰酶,抑制脯氨酰4-羟化酶(P4H)可产生不稳定胶原,胶原生成减少。TNF-a,TGFp和白介素等多种细胞因子都可以调控脯氨酰4-羟化酶活性。在这些细胞因子中,IL-6是参与心血管发病和有效调控细胞外基质代谢的重要的细胞因子之一。我们初步研究发现20ng／ml的IL-6刺激平滑肌细胞24小时后,使P4Hα1的mRNA和蛋白质表达水平显著降低。脂联素作为脂肪细胞源性血浆蛋白是一种保护性因素,能够对抗导致动脉粥样硬化斑块易损性的多种因素,包括炎症、氧化应激、细胞外基质的降解和重构等。研究表明,脂联素通过抑制炎症因子TNF-α、IL-6等的激活调控内皮细胞的炎症反应；细胞研究表明,脂联素能够抑制炎症因子诱导的MMP-9表达增高并参与基质降解、血管平滑肌细胞增殖和迁移。这些研究表明脂联素具有抗炎活性并可能调控细胞外基质代谢。我们体内研究结果亦表明：脂联素过表达可显著增加动脉粥样硬化内P4Hα1表达,但脂联素影响P4Hα1表达的信号通路目前尚不清楚。MAPK通路是由细胞因子激活的细胞内的信号转导通路,它可分为3组：ERK,JNK,和p38 MAPK,其中ERK与炎症、脂联素的生物学效应和细胞外基质代谢密切相关。大量研究表明,炎症因子和脂联素均可通过调控ERK1／2-MAPK通路发挥重要的生物学作用；另有研究表明,胶原代谢过程的调节也需要ERK1／2-MAPK通路的参与。细胞因子、生长因子、神经递质等多种刺激均可活化MAPKs,活化的MAPKs一方面磷酸化胞浆内的靶蛋白,另一方面作用于转录因子,调节基因的表达,进而调节细胞生长、发育及细胞功能等多种生理过程。Sp1是最早发现的真核细胞的转录因子之一,研究发现,转录因子Sp1在胶原代谢过程中起重要的调节作用,作为MAPK下游重要的靶信号分子,Sp1可以被ERK活并使其与DNA的结合活性增强,进而导致目的基因转录减少。通过检索(http://motif.genome.jp/)我们发现P4Hα1的启动子区域含有Sp1的结合位点。这说明IL-6介导的平滑肌细胞P4Hal表达可能通过Sp1发挥作用。基于以上,我们提出如下假说：脂联素可能通过ERK1/2-MAPK通路调节IL-6介导的平滑肌细胞P4Hα1的表达水平,激活的ERK1/2-MAPK通路通过调节转录因子Sp1活性,在转录水平调节P4Hα1表达,并进一步影响胶原代谢。本研究针对这一假说进行研究。研究目的1.明确脂联素对IL-6介导的平滑肌细胞P4Hα1表达的作用；2.明确脂联素上调IL-6介导的平滑肌细胞4Hα1表达过程中ERK1／2的作用；3.明确脂联素上调IL-6介导的平滑肌细胞P4Hα1表达过程中转录因子Sp1的作用。研究方法1.平滑肌细胞的培养：人主动脉平滑肌细胞(HASMCs,human aortic smooth muscle cells)购自CELLSCIENCE公司,使用CELLSCIENCE公司的平滑肌培养基,在37℃和5%CO2孵育箱中进行培养。前4代细胞冻存于液氮罐中保存,5-8代细胞行细胞试验。细胞在37℃,5%CO2孵箱中培养至80%-90%融合,刺激前无血清饥饿培养至少24小时。2.实验分组2.1根据IL-6的不同作用时间及不同浓度梯度分组为了观察不同作用时间及不同浓度梯度IL-6刺激平滑肌细胞P4Hα1表达的变化,按照IL-6的作用浓度分为5个组：平滑肌细胞空白对照组,10ng／ml IL-6处理组,20ng／ml IL-6处理组,50ng／ml IL-6处理组,100ng／ml IL-6处理组。根据IL-6不同作用时间分为5个组：平滑肌细胞空白对照组,IL-6处理6小时组,IL-6处理12小时组,IL-6处理24小时组,IL-6处理48小时组。处理后收集细胞,应用RT-PCR和蛋白印迹方法分别检测P4Hal的mRNA和蛋白质水平的变化。2.2根据脂联素的不同作用时间及不同浓度梯度分组为了观察不同作用时间及不同浓度梯度脂联素刺激情况下IL-6介导的平滑肌细胞P4Hα1表达的变化,按照脂联素的作用浓度分为8个组：平滑肌细胞空白对照组,平滑肌细胞+20ng／ml IL-6对照组,平滑肌细胞+Ad.Empty对照组,5MOI Ad.Adipo+20ng/ml IL-6处理组,10MOI Ad.Adipo+20ng/ml IL-6处理组,20MOI Ad.Adipo+20ng/ml IL-6处理组,50MOI Ad.Adipo+20ng/ml IL-6处理组,100MOI Ad.Adipo+20ng/ml IL-6处理组。根据脂联素不同作用时间分为7个组：平滑肌细胞空白对照组,平滑肌细胞+20ng／ml IL-6对照组,平滑肌细胞+Ad.Empty对照组,Ad.Adipo+20ng/ml IL-6处理4小时组,Ad.Adipo+20ng/mlIL-6处理8小时组,Ad.Adipo+20ng/ml IL-6处理12小时组,Ad.Adipo+20ng/mlIL-6处理24小时组。处理后收集细胞,应用RT-PCR和蛋白印迹方法分别检测P4Hal的mRNA和蛋白质水平的变化。2.3脂联素上调IL-6介导的平滑肌细胞P4Hα1表达过程中Sp1作用实验分组1)静态组：不给予任何处理,观察Spl的DNA结合活性,Sp1的亚细胞分布的变化以及P4Hα1 mRNA表达及其蛋白质水平的变化；2)WP631组：只给予0.1μM Sp1抑制剂WP631刺激平滑肌细胞1小时,观察Spl的DNA结合活性,Spl的亚细胞分布的变化以及P4Hα1 mRNA表达及其蛋白质水平的变化；3)脂联素组：以10MOI的脂联素腺病毒载体刺激平滑肌细胞8小时,观察Sp1的DNA结合活性,Sp1的亚细胞分布的变化以及P4Hα1 mRNA表达及其蛋白质水平的变化；4)WP631+脂联素组：给予0.1μM Sp1抑制剂WP631刺激平滑肌细胞1小时,再以10MOI的脂联素腺病毒载体刺激平滑肌细胞8小时,观察Sp1的DNA结合活性,Sp1的亚细胞分布的变化以及P4Hα1 mRNA表达及其蛋白质水平的变化；5)IL-6组：以20ng／ml的IL-6刺激平滑肌细胞0min,15min,30min,1小时,2小时,24小时,观察Sp1的DNA结合活性,Spl的亚细胞分布的变化以及P4Hα1mRNA表达及其蛋白质水平的变化；6)脂联素+IL-6组：先以10MOI的脂联素腺病毒载体刺激平滑肌细胞8小时,再以20ng／ml的IL-6刺激平滑肌细胞1小时,24小时,观察Sp1的DNA结合活性,Sp1的亚细胞分布的变化以及P4Hα1 mRNA表达及其蛋白质水平的变化；7)WP631+IL-6组：先给予0.1μM Sp1抑制剂WP631刺激平滑肌细胞1小时,再以20ng／ml的IL-6刺激平滑肌细胞1小时,24小时,观察Sp1的DNA结合活性,Sp1的亚细胞分布的变化以及P4Hα1 mRNA表达及其蛋白质水平的变化；8)WP631+脂联素+IL-6组：先给予0.1μM Sp1抑制剂WP631刺激平滑肌细胞1小时,再以10MOI的脂联素腺病毒载体刺激平滑肌细胞8小时,最后以20ng／ml的IL-6刺激平滑肌细胞1小时,24小时,观察Sp1的DNA结合活性,Spl的亚细胞分布的变化以及P4Hα1 mRNA表达及其蛋白质水平的变化。2.4脂联素上调IL-6介导的平滑肌细胞Sp1／P4Hα1信号转导通路过程中ERK1／2的作用实验分组1)静态组：不给予任何处理,观察ERK1／2的磷酸化水平,Sp1的DNA结合活性,Sp1的亚细胞分布的变化以及P4Hα1 mRNA表达和蛋白质水平的变化；2)PD98059组：给予20μM ERK12抑制剂PD98059刺激平滑肌细胞1小时,观察ERK1／2的磷酸化水平,Sp1的DNA结合活性,Sp1的亚细胞分布的变化以及P4Hα1 mRNA表达和蛋白质水平的变化；3)脂联素组：以10MOI的脂联素腺病毒载体刺激平滑肌细胞8小时,观察ERK1／2的磷酸化水平,Sp1的DNA结合活性,Sp1的亚细胞分布以及P4Hα1 mRNA表达和蛋白质水平的变化；4)PD98059+脂联素组：先给予20μM ERK1／2抑制剂PD98059刺激平滑肌细胞1小时,再以10MOI的脂联素腺病毒载体刺激平滑肌细胞8小时,观察ERK1／2的磷酸化水平,Sp1的DNA结合活性,Sp1的亚细胞分布的变化以及P4Hα1 mRNA表达和蛋白质水平的变化；5)IL-6组：以20ng/ml的IL-6刺激平滑肌细胞0min,2min,5min,15mm,30min,1小时,24小时,观察ERK1／2的磷酸化水平,Sp1的DNA结合活性,Sp1的亚细胞分布的变化以及P4Hα1 mRNA表达和蛋白质水平的变化；6)脂联素+IL-6组：先以10MOI的脂联素腺病毒载体刺激平滑肌细胞8小时,再以20ng／ml的IL-6刺激平滑肌细胞5min,1小时,24小时,观察ERK1／2的磷酸化水平,Sp1的DNA结合活性,Sp1的亚细胞分布的变化以及P4Hα1 mRNA表达和蛋白质水平的变化；7)PD98059+IL-6组：先给予20μM ERK1／2抑制剂PD98059刺激平滑肌细胞1小时,再以20ng／ml的IL-6刺激平滑肌细胞5min,1小时,24小时,观察ERK1／2的磷酸化水平,Spl的DNA结合活性,Spl的亚细胞分布的变化以及P4Hα1 mRNA表达和蛋白质水平的变化；8)PD98059+脂联素+IL-6组：先给予20μM ERK1／2抑制剂PD98059刺激平滑肌细胞1小时,再以10MOI的脂联素腺病毒载体刺激平滑肌细胞8小时,最后以20ng／ml的IL-6刺激平滑肌细胞5min,1小时,24小时,观察ERK1／2的磷酸化水平,Sp1的DNA结合活性,Sp1的亚细胞分布以及P4Hα1 mRNA表达和蛋白质水平的变化。3.实时定量RT-PCR：实时荧光定量RT-PCR反应检测脂联素上调IL-6介导的平滑肌细胞P4Hα1表达过程中P4Hα1 mRNA的表达水平变化。4.免疫印迹(Westenr blot)检测：免疫印迹(Westenr blot)检测脂联素上调IL-6介导的平滑肌细胞P4Hα1表达过程中ERK1／2的磷酸化水平和P4Hα1的蛋白质水平变化。5.凝胶迁移或电泳迁移率实验(EMSA)检测：凝胶迁移或电泳迁移率实验(EMSA)检测脂联素上调IL-6介导的平滑肌细胞P4Hα1表达过程中Sp1的DNA结合活性的变化。6.免疫细胞荧光染色：免疫细胞荧光染色检测脂联素调控IL-6介导的平滑肌细胞Sp1的亚细胞分布的变化。结果1.IL-6降低P4Hα1表达的浓度和时间-效应关系为明确IL-6降低P4Hα1表达是否呈浓度和时间依赖性,我们分别以不同浓度0ng／ml、10ng／ml、20ng／ml、50ng／ml和100ng／ml的IL-6分别刺激平滑肌细胞0、6、12、24、48小时后,应用RT-PCR方法和免疫印记方法分别检测P4Hα1的mRNA和蛋白质水平的变化。结果表明：在同一刺激时间的IL-6组间,IL-6对P4Hal的作用呈浓度依赖性,20ng／ml IL-6处理组与对照组比较,P4Hα1的mRNA显著下降65%(P<0.05),蛋白质表达水平显著下降70%,达到高峰(P<0.05)。在同一浓度IL-6刺激平滑肌细胞的条件下,IL-6对P4Hα1的作用呈时间依赖性,在处理24小时后,与对照组相比,P4Hα1的mRNA显著下降65%(P<0.05),蛋白质表达水平显著下降70%,达到高峰(P<0.05)。2.脂联素对IL-6介导的平滑肌细胞P4Hα1表达作用的浓度和时间-效应关系为明确脂联素对IL-6介导的平滑肌细胞P4Hα1表达是否呈浓度和时间依赖性,我们以不同的浓度OMOI、5MOI、10MOI、20MOI、50MOI、100MOI的脂联素腺病毒载体分别刺激平滑肌细胞0、4、8、12、24小时,再以20ng／ml IL-6刺激平滑肌细胞24小时,应用RT-PCR方法和蛋白印迹方法分别检测P4Hα1的mRNA和蛋白质水平的变化。结果表明：在同一刺激时间的脂联素腺病毒载体组间,脂联素腺病毒载体对P4Hα1的作用呈浓度依赖性,10MOI的脂联素腺病毒载体处理组与对照组比较,P4Hα1的mRNA升高3.2倍(P<0.05),蛋白质表达水平显著上升3倍(P<0.05),达到高峰。在同一浓度脂联素腺病毒载体刺激平滑肌细胞的条件下,脂联素腺病毒载体对P4Hα1的作用呈时间依赖性,与对照组比较,在处理8小时后P4Hα1的mRNA显著升高2.5倍(P<0.05),蛋白质表达水平显著升高2倍(P<0.05),达到高峰。3.脂联素上调IL-6介导的平滑肌细胞P4Hα1表达过程中Sp1的作用3.1脂联素上调IL-6介导的平滑肌细胞P4Hα1表达过程中Sp1的DNA结合活性的变化以20ng／ml的IL-6刺激平滑肌细胞0,15min,30min,1小时,2小时后,收集细胞,提取核蛋白,用EMSA检测试剂盒检测Sp1的DNA结合活性,结果显示：与静态组相比,在处理15min后Sp1的DNA结合活性开始逐渐升高20%(P<0.05),1小时后升高达到高峰(P<0.05),随后Sp1的DNA结合活性开始逐渐降低,根据该结果,先给予0.1μM Sp1的抑制剂WP631刺激平滑肌细胞1小时,再以10MOI的脂联素腺病毒载体刺激平滑肌细胞8小时,最后以20ng／ml的IL-6刺激平滑肌细胞1小时,结果显示：与静态组相比,IL-6组平滑肌细胞内的Sp1的DNA结合活性显著增加(P<0.05),与IL-6组比较,脂联素+IL-6组平滑肌细胞的Sp1的DNA结合活性降低了60%(P<0.05),WP631+IL-6组平滑肌细胞的Sp1的DNA结合活性降低了95%(P<0.05),WP631+脂联素+IL-6组平滑肌细胞的Sp1的DNA结合活性降低了大约90%(P<0.05),与静态组相比,脂联素组、WP631组、WP631+脂联素组、WP631+IL-6组和WP631+脂联素+IL-6组平滑肌细胞的Sp1的DNA结合活性无显著性差异(P>0.05)。3.2脂联素调控IL-6介导的平滑肌细胞内Spl的亚细胞分布变化先给予0.1μMSp1的抑制剂WP631刺激平滑肌细胞1小时,再以10MOI的脂联素腺病毒载体刺激平滑肌细胞8小时,最后以20ng／ml的IL-6刺激平滑肌细胞1小时,采用细胞免疫荧光染色观察Sp1的亚细胞分布变化。结果显示：与静态组相比,IL-6组平滑肌细胞核内的Sp1免疫荧光强度增强8倍(P<0.05)；与IL-6组比较,脂联素+IL-6组平滑肌细胞核内的Spl免疫荧光强度降低了70%(P<0.05),WP631+IL-6组平滑肌细胞核内的Spl免疫荧光强度与静态组相近,与IL-6组比较,差异有统计学意义(P<0.05),WP631+脂联素+IL-6组平滑肌细胞核内的Sp1免疫荧光强度与静态组相近,与IL-6组比较,差异有统计学意义(P<0.05),与静态组相比,脂联素组、WP631组、WP631+脂联素组、WP631+IL-6组和WP631+脂联素+IL-6组平滑肌细胞核内的Sp1免疫荧光强度无显著性差异(P>0.05)。3.3 Sp1对脂联素上调IL-6介导的平滑肌细胞P4Hα1表达的作用先给予0.1μMSp1的抑制剂WP631刺激平滑肌细胞1小时,再以10MOI的脂联素腺病毒载体刺激平滑肌细胞8小时,最后以20ng／ml的IL-6刺激平滑肌细胞24小时,分别提取RNA和蛋白,应用RT-PCR方法和蛋白印迹方法分别检测P4Hα1的mRNA和蛋白质水平的变化。结果显示：与静态组相比,IL-6组平滑肌细胞P4Hα1mRNA降低65%(P<0.05),蛋白质的表达水平降低70%(P<0.05),与IL-6组比较,脂联素+IL-6组平滑肌细胞P4Hα1 mRNA增加5.8倍(P<0.05),蛋白质的表达水平增加6倍(P<0.05),WP631+IL-6组平滑肌细胞P4Hα1 mRNA和蛋白质表达水平与静态组接近,与IL-6组比较,差异有统计学意义(P<0.05),WP631+脂联素+IL-6组平滑肌细胞P4Hα1 mRNA和蛋白质表达水平与静态组接近,与IL-6组比较,差异有统计学意义(P<0.05),与静态组相比,脂联素组、WP631组、WP631+脂联素组、WP631+IL-6组和WP631+脂联素+IL-6组平滑肌细胞P4Hα1mRNA表达和蛋白质表达水平均无显著性差异(P>0.05)。4.脂联素上调IL-6介导的平滑肌细胞Sp1-4Hα1信号转导通路过程中ERK1／2的作用4.1脂联素上调IL-6介导的平滑肌细胞P4Hα1表达过程中ERK1／2磷酸化水平的变化以20ng／ml的IL-6分别刺激平滑肌细胞0min,2min,5min,15min,30min,用蛋白印迹方法检测ERK1／2的蛋白磷酸化水平,结果显示：ERK1／2的磷酸化水平变化呈时间依赖性,与静态组相比,在处理2min后ERK1／2的磷酸化水平开始逐渐升高达20%(P>0.05),5min后升高达到高峰(P<0.05),随后ERK1／2的磷酸化水平开始逐渐降低。根据该结果,将平滑肌细胞与ERK1／2的抑制剂PD9805920μM共培养1小时,再以10MOI的脂联素腺病毒载体刺激平滑肌细胞8小时,最后以20ng／ml的IL-6刺激5分钟,结果显示：与静态组相比,IL-6组平滑肌细胞的ERK1／2磷酸化水平显著增高(P<0.05),与IL-6组比较,脂联素+IL-6组平滑肌细胞的ERK1／2磷酸化水平降低了70%(P<0.05),PD98059+IL-6组平滑肌细胞的ERK1／2磷酸化水平降低了95%(P<0.05),PD98059+脂联素+IL-6组平滑肌细胞的ERK1／2磷酸化水平降低了92%(P<0.05),与静态组相比,脂联素组、PD98059组、PD98059+脂联素组、PD98059+IL-6组和PD98059+脂联素+IL-6组平滑肌细胞的ERK1／2磷酸化水平无显著性差异(P>0.05)。4.2脂联素上调IL-6介导的平滑肌细胞P4Hα1表达过程中ERK1／2对Sp1的DNA结合活性的作用先给予20μM ERK1／2的抑制剂PD98059刺激平滑肌细胞1小时,再以10MOI的脂联素腺病毒载体刺激平滑肌细胞8小时,最后以20ng／ml的IL-6刺激平滑肌细胞1小时,收集细胞,提取核蛋白,用EMSA检测试剂盒来检测Sp1的DNA结合活性。结果显示：与静态组相比,IL-6组平滑肌细胞内的Sp1的DNA结合活性显著增加(P<0.05),与IL-6组比较,脂联素+IL-6组平滑肌细胞的Sp1的DNA结合活性降低了80%(P<0.05),PD98059+IL-6组平滑肌细胞的Sp1的DNA结合活性降低了95%(P<0.05),PD98059+脂联素+IL-6组平滑肌细胞的Sp1的DNA结合活性降低了大约93%(P<0.05),与静态组相比,脂联素组、PD98059组、PD98059+脂联素组、PD98059+IL-6组和PD98059+脂联素+IL-6组平滑肌细胞的Sp1的DNA结合活性无显著性差异(P>0.05)。4.3脂联素上调IL-6介导的平滑肌细胞P4Hα1表达过程中ERK1／2对Sp1的亚细胞分布变化的作用先给予20μM ERK1／2的抑制剂PD98059刺激平滑肌细胞1小时,再以10MOI的脂联素腺病毒载体刺激平滑肌细胞8小时,最后以20ng／ml的IL-6刺激平滑肌细胞1小时,采用细胞免疫荧光染色观察Sp1的亚细胞分布的变化。结果显示：与静态组相比,IL-6组平滑肌细胞核内的Sp1免疫荧光强度增强7倍(P<0.05),与IL-6组比较,脂联素+IL-6组平滑肌细胞核内的Sp1免疫荧光强度降低了70%(P<0.05),PD98059+IL-6组平滑肌细胞核内的Sp1免疫荧光强度与静态组相近,与IL-6组比较,差异有统计学意义(P<0.05),PD98059+脂联素+IL-6组平滑肌细胞核内的Sp1免疫荧光强度与静态组相近,与IL-6组比较,差异有统计学意义(P<0.05),与静态组相比,脂联素组、PD98059组、PD98059+脂联素组、PD98059+IL-6组和PD98059+脂联素+IL-6组平滑肌细胞核内的Sp1免疫荧光强度无显著性差异(P>0.05)。4.4 ERK1／2对脂联素上调IL-6介导的平滑肌细胞P4Hα1表达的作用先给予20μM ERK1／2的抑制剂PD98059刺激平滑肌细胞1小时,再以10MOI的脂联素腺病毒载体刺激平滑肌细胞8小时,最后以20ng／ml的IL-6刺激平滑肌细胞24小时,分别提取RNA和蛋白,应用RT-PCR方法和蛋白印迹方法分别检测P4Hα1的mRNA和蛋白质水平的变化。结果显示：与静态组相比,IL-6组平滑肌细胞P4Hα1 mRNA降低65%(P<0.05),蛋白质表达水平降低70%(P<0.05),与IL-6组比较,脂联素+IL-6组平滑肌细胞P4Hα1 mRNA增加6.3倍(P<0.05),蛋白质表达水平增加7倍(P<0.05),PD98059+IL-6组平滑肌细胞P4Hα1 mRNA和蛋白质表达水平与静态组接近,与IL-6组比较,差异有统计学意义(P<0.05),PD98059+脂联素+IL-6组平滑肌细胞P4Hα1 mRNA和蛋白质表达水平与静态组接近,与IL-6组比较,差异有统计学意义(P<0.05),与静态组相比,脂联素组、PD98059组、PD98059+脂联素组、PD98059+IL-6组和PD98059+脂联素+IL-6组平滑肌细胞P4Hα1 mRNA表达和蛋白质表达水平均无显著性差异(P>0.05)。创新性与限制性创新性(1)首次研究表明保护性因子脂联素可以上调炎性平滑肌细胞P4Hα1表达,至今尚未见相关报道。(2)本研究首次提出Sp1／ERK1／2-MAPKs／P4Hα1这一信号途径参与了脂联素调控炎性平滑肌细胞P4Hα1表达过程。限制性本研究未对该信号途径可能涉及的其它分子进行更深入细致的研究。结论：1.炎症因子IL-6可显著抑制平滑肌细胞P4Hα1表达,脂联素作为具有抗炎活性的脂肪细胞源性血浆蛋白可显著上调IL-6介导的平滑肌细胞P4Hα1表达；2.在脂联素上调IL-6介导的平滑肌细胞P4Hα1表达过程中,Sp1作为重要的转录因子参与了P4Hα1表达的调节；3.在脂联素上调IL-6介导的平滑肌细胞Sp1／P4Hα1信号转导通路过程中,ERK1／2参与了P4Hα1表达的调节。总之,脂联素可以通过Sp1／ERK1／2-MAPKs／P4Hα1信号途径上调IL-6介导的平滑肌细胞P4Hα1表达。