在猪生产中,产后断奶母猪尽快怀孕有助于达到猪群的最佳繁殖性能,但是生产中存在大量母猪产后乏情或假发情的现象。应激可能是其中一个影响因素,但其机制仍不明确。动物处于应激状态时,HPA系统被激活,引起促肾上腺皮质素释放素(CRH),促肾上腺皮质素(ACTH)及糖皮质激素皮质醇级联释放。长期应激或慢性应激致使ACTH和皮质醇增加延长,严重影响下丘脑和腺垂体功能,扰乱繁殖过程。作为重要的应激激素,ACTH处理被用于研究应激激素在多个生殖过程中的作用。先前的研究报道揭示了短期重复ACTH处理对母猪发情的影响;然而,长期重复ACTH处理对断奶后母猪发情的影响鲜有研究,特别是长期重复ACTH处理对断奶后母猪卵巢内多个连续生理活动如卵泡发育、优势化、排卵及黄体形成的影响尚不清楚。此外,关于应激激素影响黄体发育的机制尚不清楚。先前的研究主要从单个基因或少数基因进行研究,尚无研究利用无偏差全基因组的方法探究应激影响黄体发育的潜在机制。DNA甲基化是一个与基因表达相关的重要表观遗传机制,广泛参与细胞分化,胚胎发生,X-失活,基因组印记以及肿瘤发生等生物学过程。到目前为止,尚不清楚母猪黄体组织的全基因组DNA甲基模式;此外,慢性应激状态下形成的黄体组织是否发生DNA甲基化改变,及其DNA甲基化改变是否影响基因表达还尚无研究报道。为了阐明长期重复ACTH处理对断奶后母猪繁殖及黄体甲基化及基因表达的影响,本研究选用同期产后断奶的苏淮母猪,以8小时间隔注射ACTH,为期7天,以建立断奶后母猪慢性应激模型。通过检测血清激素浓度、发情时间、卵泡形态,评估长期重复ACTH处理对产后断奶母猪繁殖的影响;利用全基因组DNA甲基化测序及RNA测序分别分析ACTH处理对断奶后母猪黄体DNA甲基化组及转录组的影响;结合差异甲基化区域分析及差异基因表达分析,筛选ACTH处理影响黄体发育的潜在基因及其可能机制。最后本文通过体外培养母猪黄体细胞和体内小鼠皮质酮注射试验综合验证皮质醇对相关差异基因表达的影响。结果表明:1.对经产断奶母猪长期重复注射外源ACTH显著上调母猪血液中皮质醇、血糖、乳酸脱氢酶、肌酸激酶、甘油三酯和总胆固醇的浓度。结果提示ACTH处理影响母猪糖代谢、脂肪代谢和能量代谢。ACTH处理增加母猪血液中白蛋白的浓度及白细胞和中性粒细胞的数量,降低淋巴细胞的数量(P<0.05);结果表明ACTH处理导致母猪出现应激类似反应。2.本研究所有母猪都表现出正常的发情行为及压背静立反应;但ACTH组母猪平均发情时间(99.00 ± 1.22 h)比对照组(84.00±4.95 h)延迟。在试验期36h,42h及66h时,ACTH组雌激素浓度显著低于对照组(P<0.05);在试验期132h,138h及147h,ACTH组孕酮浓度显著低于对照组(P<0.05)。ACTH处理显著降低发情期间LH的分泌(P<0.05);发情期ACTH组的平均孕酮浓度显著低于对照组。对照组所有母猪均在发情期出现LH 峰,而ACTH组有三头母猪出现LH峰。对照组LH峰出现的时间为108.80±5.54 h,ACTH组LH峰出现的时间为136.30±3.75 h,两组间差异显著(P<0.05)。ACTH组皮质醇与孕酮浓度呈负相关(R=0.738,P=0.012)。母猪生殖器官剖检未发现解剖异常、感染迹象或卵巢囊肿。对照组所有母猪都发生排卵,且卵巢上形成黄体;ACTH组三头母猪发生排卵且形成黄体。对照组母猪排卵率为100%,ACTH组母猪排卵率为60%。两组间卵巢脏器指数差异不显著(ACTH组排卵母猪8.85±0.88;对照组7.81±0.57),母猪卵巢排卵卵泡数两组间差异不显著(ACTH组排卵母猪18.50±1.32;对照组17.33±1.45)。此外,与对照组相比,ACTH组母猪黄体中LHR表达下调(P<0.05),而FSHR和GR表达无显著变化。3.WGBS测序共生成18.25亿reads和228.19 Gb数据。经过数据质量控制后,约有 17.99 亿 clean reads(224.91Gb),68.55%的 clean reads 能比对到猪参考基因组(Sscrofa 10.2)。平均每个样本含有约5172 Mb的C位点,每个样本约含有272 Mb的GC位点。对照组基因组甲基化C位点百分比约为4.23%,而ACTH组约为4.20%。对照组黄体组织mC组成比例为93.97%mCG,1.72%mCHG及4.31%mCHH;而ACTH组黄体组织mC组成比例为95.27%mCG,1.29%mCHG及3.44%mCHH。通过全基因组DNA甲基化图谱比较,结果直观地表明对照组与ACTH组在各个染色体的许多区域存在差异甲基化区域,特别是X染色体。比较基因密度与DNA甲基化水平,结果显示基因密度与甲基化水平呈负相关。根据染色体中基因密度的分布,两组间甲基化水平的差异主要表现在基因密度低的染色体区域。两组基因功能区域的CG甲基化模式为5’UTR低甲基化,内含子、外显子及3’UTR超甲基化。除了启动子区域,对照组其它功能区域的甲基化水平低于ACTH组;对照组5’UTR的CG甲基化密度低于ACTH组。两组启动子区域、5’UTR、外显子及3’UTR的CHG和CHH甲基化水平和甲基化密度均存在很大差异。但两组功能区域的CGIs甲基化模式类似,即转录起始位点(TSS)超甲基化,而TSS上下游5kb区域低甲基化。根据启动子区域CG含量,将基因分为启动子高CG基因(HCPs)和启动子低CG基因(LCPs)。HCPs和LCPs的TSS上游5kb区域70%CG位点甲基化,且基因体超甲基化。两组在HCPs的内含子区域及LCPs转录终止位点(TES)下游2kb区域的甲基化模式存在差异。本研究共鉴定出88557个差异甲基化区域(DMRs);与对照组相比,ACTH组高甲基化的DMRs为54530个,低甲基化的DMRs为34027个。DMRs的长度分布符合高斯分布;各染色体上的DMRs长度分布主要集中在100 bp到500 bp之间。经注释,与高甲基化DMRs相关的基因为1899个,与低甲基化DMRs相关的基因为118个。GO富集分析显示大量的基因富集在代谢相关的生物过程(P=2.39E-30,G0:0008152)。此外,许多DMRs相关基因富集在细胞分化生物过程(P=7.63E-14,G0:0030154)。分子功能分析结果显示,大量的基因富集在binding(GO:0005488)及 protein binding(GO:0005515)生物功能上。4.转录组测序共生成1.41亿reads,约有76.17%的clean reads比对到猪基因组(Sscrofa 10.2)。两组共表达基因12772个,仅ACTH组表达基因290个,仅对照组表达基因439个。两组间基因差异表达分析筛选出9个差异表达基因(DEGs);其中7个基因在ACTH组表达上调,2个基因在ACTH组表达下调。GO分析显示在生物学过程和分子功能上DEGs与氧运输密切相关。KEGG通路分析显示DEGs中两个基因涉及机体免疫相关的非洲锥虫病和疟疾相关通路。利用qRT-PCR对黄体组织差异表达基因进行验证。结果表明,9个差异表达基因中7个基因表达差异显著且趋势与RNA-seq一致。利用条件筛选,从7个表达差异基因中筛选出4个差异甲基化基因及差异表达基因,分别是:EPB41L3,SLC5A2,FBXO2及ONS1。我们推断这4个差异甲基化相关基因可能参与长期重复ACTH处理条件下黄体发育及功能调控。5.小鼠体内试验及母猪黄体细胞体外培养试验证明EPB41L3,QNS1及FBXO2基因参与黄体发育过程;且皮质醇/皮质酮影响它们的mRNA表达。但皮质醇/皮质酮对DEGs表达的影响与ACTH处理不完全一致,该结果提示ACTH处理对母猪黄体甲基化及基因表达的影响不完全或直接依赖于皮质醇。综上所述,本文系统地研究了长期重复ACTH处理状态下母猪从断奶到排卵后体内促性腺激素,性腺激素的动态变化;本研究表明长期应激刺激诱导的ACTH及皮质醇持续升高可能影响母猪发情期卵泡正常发育,抑制排卵前LH峰,阻碍排卵,并可能影响黄体功能。本研究绘制了母猪的黄体基因组DNA甲基化分布图谱,鉴定了长期ACTH处理导致黄体组织差异甲基化区域及差异表达基因,这些基因可能涉及黄体发育及功能调控。本研究结果从表观遗传角度揭示了应激影响黄体发育及功能的潜在分子机制,为进一步研究黄体功能障碍的发病机制提供新思路。