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玉屏风散由黄芪[Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge. var. mongholicus (Bge.) Hsiao]、白术(炒)[Rhizoma Atractylodis Macrocephalae (baked)]、防风[Saposhnikovia divaricata (Turez.) Schischk.]三味组成,为治疗表虚自汗的经典名方。现代中药研究认为,由于中药独特用药体系和多以复方形式用药的特点,中药复方真正发挥药理作用的活性物质基础,是指复方中产生某种药效活性物质的总和,因此研究中我们从玉屏风散整体出发追踪其多糖类活性成分,而非分别研究三味组成单药的活性多糖再加以配伍组合。在我们的前期研究中,对玉屏散总多糖进行了分级分离,通过活性筛选证实了玉屏风多糖(YPF-P)为玉屏风散中最具药理活性的多糖类成分,且发现YPF-P对环磷酰胺诱导的免疫力低下小鼠具有免疫调节活性,对于急性化学性及急性免疫性肝损伤均具有一定的肝脏保护作用。在此基础上,本课题组秉持药物化学研究与药理研究密切结合的研究思路,一方面从玉屏风散复方整体中优化提取YPF-P,并通过多种化学及仪器检测深入研究YPF-P的组成及结构,为阐明玉屏风散活性多糖的构效关系提供化学基础;另一方面,通过CCl4诱导的大鼠肝纤维化模型,从血清学、组织学、分子生物学等水平系统观察YPF-P对大鼠肝纤维化的防治作用及其可能的发生机制,并考察YPF-P及其主成分多糖YPF-P1对体外培养的HSC-T6生长及对TGF-β1刺激后HSC-T6增殖的影响,为抗肝纤维化治疗研究和临床慢性肝病的防治提供新的药物选择。研究主要内容如下:1.玉屏风多糖(YPF-P)的制备及多糖组成结构研究YPF-P制备实验旨在通过正交试验设计法优选YPF-P的提取工艺条件,并建立YPF-P的含量测定方法。实验采用L9(34)正交试验设计法制备玉屏风散活性多糖,通过分光光度计以苯酚硫酸法测定多糖含量,以多糖提取量为指标优选YPF-P最佳提取工艺。结果提示,YPF-P提取的最佳条件为料液比1:15,于90°С提取3次,每次2h。实验中成功建立了YPF-P的含量测定方法,验证试验表明优选出的提取工艺稳定、合理、可行。YPF-P组成结构研究旨在考察YPF-P的组成及其主成分多糖(YFP-P1)的化学结构特征,以期阐明复方玉屏风散的药效物质基础。实验从复方玉屏风散中经水提醇沉、脱蛋白后得到YPF-P,先后经DEAE sephadex A-25柱分离和Sephadex G-200柱进一步纯化,得到3个重均分子量均一的多糖YPF-P1、YPF-P2、YPF-P3,通过高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)测定多糖分子量;通过多糖完全酸水解,通过薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)两种方法进行YPF-P1单糖组成研究,并进行高碘酸氧化、红外光谱(IR)、1H-NMR及13C-NMR谱检测以掌握YFP-P1的基本结构特征。实验结果表明,YPF-P的组成多糖分子量分别为YPF-P1(488,500Da)、YPF-P2(232,500Da)、YPF-P3(1,863,000Da);YPF-P1为一高度分支化的杂多糖,由葡萄糖(Glc),半乳糖(Gal),果糖(Fru)及阿拉伯糖(Ara)以摩尔比3: 2.5: 1.75: 1组成,此外还含有微量的鼠李糖(Rha),半量的Gal以半乳糖醛酸(GalA)形式存在,主链部分由1, 6-α-D-吡喃葡萄糖苷、1, 6-β-D-吡喃半乳糖以6: 5构成,侧链部分由1, 3-β-D-呋喃果糖苷,甲基-β-呋喃阿拉伯糖苷和/或甲基-α-鼠李糖苷构成,与葡萄糖残基O-6相连。2.玉屏风多糖(YPF-P)对实验性肝纤维化的预防作用及机制研究实验旨在考察YPF-P对大鼠肝纤维化的药效作用及部分机制,并研究对HSC-T6细胞株增殖的影响。体内实验中,通过给予SD大鼠皮下注射CCl4花生油溶液12周,每周2次,成功建立肝纤维化模型;大鼠随机分为正常组,模型组,YPF-P (30, 60, 120 mg·kg?1)三剂量组,黄芪多糖(AP)60 mg·kg?1组,秋水仙碱阳性药对照组;采用Masson染色观察肝脏病理组织学改变,电镜观察肝细胞、HSC形态,放免法测定血清HA、LN、CIV、PCIII水平,血清TGF-β1水平及肝组织TGF-β1蛋白含量分别由ELISA和免疫组化法测定,肝组织α-SMA蛋白与mRNA水平经免疫组化法和RT-PCR法测定,TIMP-1、MMP-13、Procollagen ?、CollagenШmRNA均经RT-PCR法测定。结果显示,YPF-P能够显著减轻肝纤维化病变程度,抑制HSC向MFb的转化进程,显著降低肝纤维化时升高的血清HA、LN、CIV、PCIII、TGF-β1水平,减少肝组织TGF-β1蛋白及α-SMA蛋白、基因的表达,显著抑制TIMP-1、Procollagen ?、Collagen III mRNA表达,促进TIMP-1/MMP-13比例恢复,除YPF-P 120 mg·kg?1组增加MMP-13 mRNA表达(p<0.05)外,其它YPF-P组对其表达无显著性差异;与AP相比,YPF-P在HA、TGF-β1、TIMP-1 mRNA、TIMP-1/MMP-13 ratio、procollagen ? mRNA (p<0.05),PCШ和collagenⅢmRNA表达(p<0.01)上都具有更佳的疗效,但在血清LN, CIV和MMP-13 mRNA表达上无显著性差异。结果提示YPF-P能够有效预防CCl4诱导的大鼠肝纤维化的形成,延缓纤维化进程,作用呈剂量依赖趋势,YPF-P比AP更具有药效优势,其机制与抑制TGF-β1表达、恢复TIMP-1/MMP-13酶系的平衡,抑制基质胶原的生成促进降解有关。体外实验中,通过绘制细胞生长曲线观察YPF-P、YPF-P1对HSC-T6生长的影响,采用MTT法考察YPF-P、YPF-P1对TGF-β1诱导的HSC-T6增殖的影响。结果表明,YPF-P(50、100、200mg/L)、YPF-P1(100、200mg/L)给药均可抑制正常HSC-T6的增殖;YPF-P 50-200mg/L(p<0.01),YPF-P1 12.5-25 mg/L(p<0.05)、50-200 mg/L(p<0.01)均可抑制TGF-β1诱导的HSC-T6增殖; YPF-P1增殖抑制率多高于同等剂量的YPF-P(100 mg/L除外),24h内YPF-P增殖抑制率高于YPF-P1。结果提示,YPF-P、YPF-P1均具有对TGF-β1诱导的HSC-T6增殖抑制作用,YPF-P发挥作用较快,YPF-P1在抑制强度上更具优势。