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目的根据中国2019年发布的全国癌症统计数据显示,在全国恶性肿瘤发病率中,食管癌排名第六位;而在恶性肿瘤死亡率中,食管癌排名第四位。在我国,食管癌的发病存在明显的地域差异,高发区域主要集中在太行山脉附近,河南省林州也是我国食管癌高发区域之一。食管癌的病理分型主要分为:食管鳞癌和食管腺癌,而我国食管癌的主要病理类型为食管鳞癌。食管癌病因较为复杂,具体发病机制尚不明确,患者五年生存率仅有15%-20%,同时也缺少早期诊断与治疗食管癌的特异性标志物。食管癌的转移方式包括直接播散与浸润、淋巴结转移以及血行转移,食管鳞癌以局部浸润最为常见,同时伴有淋巴结转移。许多食管癌患者在诊断时已发生肿瘤的转移,而肿瘤转移引发的并发症也是癌症相关死亡的主要原因。因此,寻找食管癌发生发展的关键靶点,对食管癌的临床防治,提高患者五年生存率具有重要意义。PAK4是p21激活的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族(PAKs)成员之一,最初被确认为是Cdc42调节细胞骨架重组的效应子。目前研究发现PAK4参与了多种细胞生物学功能,如细胞骨架重排、细胞迁移、细胞凋亡与增殖等。在PAK家族中,PAK4与人类肿瘤联系最为紧密,研究表明,PAK4在肝癌、乳腺癌、前列腺癌等肿瘤中均是高表达的。在课题组的前期实验中,我们发现相较于正常食管上皮组织和食管上皮细胞,PAK4在食管麟癌组织以及大多数食管鳞癌细胞中是高表达的,通过体外细胞表型实验以及体内细胞移植瘤和体内转移实验发现PAK4可以促进食管鳞癌细胞的增殖、迁移和侵袭,加快食管鳞癌的进展。同时,通过pull down实验及对其结果进行质谱分析,我们发现了 LASP1可能是PAK4促进食管癌发生发展的潜在作用靶点。LASP1是最早在人类乳腺癌转移淋巴结中发现的LIM和SH3结构域蛋白1,最初被认为是一种细胞结构蛋白,近年来研究表明,LASP1参与多种细胞信号转导及转录调控等生物过程。研究发现,LASP1在多种癌症中高表达,促进癌症转移,其表达水平与患者生存率呈负相关。我们前期的实验结果表明,通过免疫共沉淀实验,发现PAK4与LASP1可以相互结合,激光共聚焦结果显示PAK4与LASP1在食管鳞癌细胞中共定位,但LASP1是否为PAK4下游分子以及PAK4调控LASP1的具体机制需要更深入的研究。本研究首先通过细胞rescue实验观察敲低LASP1对PAK4信号通路的影响以确定LASP1是否为PAK4的下游分子。通过体外激酶实验研究PAK4是否可以磷酸化LASP1,并确定磷酸化位点。通过将突变的LASP1在食管鳞癌细胞中过表达,通过体内外实验来探究磷酸化LASP1对食管鳞癌细胞迁移和侵袭的影响。最后,在过表达突变LASP1的食管鳞癌细胞中观察EMT信号通路的改变情况、磷酸化的LASP1对Snail转录水平以及蛋白质稳定性的影响,进一步探究PAK4通过磷酸化LASP1促进食管鳞癌发生发展的作用机制,为PAK4与p-LASP1(S198)可能成为临床食管鳞癌的诊断和治疗新靶点提供理论依据和实验基础。方法1.研究PAK4与LASP1上下游关系(1)细胞rescue实验:在已过表达PAK4的食管鳞癌细胞KYSE150中敲低LASP1,收集总蛋白,通过Western blot检测对EGFR细胞信号通路以及对EMT发展的影响,确定LASP1是否为PAK4的下游分子。(2)对细胞rescue实验中构建的细胞进行细胞划痕实验以及细胞侵袭实验等细胞表型实验,进一步确定LASP1是否为PAK4的下游分子。2.研究PAK4对LASP1的磷酸化调控方式(1)体外激酶反应实验:纯化LASP1蛋白,将LASP1纯蛋白与PAK4激酶共同孵育,观察PAK4是否可以磷酸化LASP1。(2)DNA定点突变,将潜在磷酸化位点的丝氨酸突变为丙氨酸,并纯化LASP1突变体纯蛋白。(3)将LASP1突变体纯蛋白与PAK4激酶再次进行体外激酶反应实验,确定LASP1可被PAK4磷酸化的位点。3.观察磷酸化LASP1对食管鳞癌侵袭转移的影响及其作用机制(1)将 pET-28a-mut-LASP1 亚克隆 pcDNA3.1-mut-LASP1。(2)将 pcDNA3.1-mut-LASP1 转染至食管鳞癌细胞 KYSE150、KYSE30 及KYSE510细胞中,建立稳定过表达LASP1突变体的食管鳞癌细胞株。(3)细胞划痕实验:观察不同磷酸化水平的LASP1对食管鳞癌细胞迁移能力的影响。(4)Transwell侵袭实验:评价不同磷酸化水平的LASP1对食管鳞癌细胞侵袭能力的影响。(5)Transwell迁移实验:评价不同磷酸化水平的LASP1对食管鳞癌细胞迁移能力的影响。(6)体内转移模型:观察不同磷酸化水平的LASP1在体内对食管鳞癌细胞转移的影响。(7)Western blot检测不同磷酸化水平的LASP1对EMT信号通路的影响。(8)RT-qPCR:检测不同磷酸化水平的LASP1细胞中Snail转录水平的影响。(9)通过放线菌酮检测不同磷酸化水平的LASP1对细胞中Snail半衰期的影响。结果1.细胞rescue实验Western blot结果表明PAK4可以通过LASP1提高p-AKT、p-ERK、N-cadherin、Vimentin 和 Snail 的表达水平。2.细胞划痕实验、Transwell侵袭实验表明PAK4可以通过LASP1而提高食管鳞癌细胞迁移能力与侵袭能力。3.体外激酶反应实验发现PAK4可以磷酸化LASP1,并且确定LASP1可在丝氨酸198位点被PAK4磷酸化。4.细胞划痕实验、Transwell迁移与侵袭实验表明磷酸化的LASP1可以提高食管鳞癌细胞的迁移与侵袭能力。5.体内肿瘤转移实验表明,LASP1-WT组、LASP1-S198D组小鼠体内荧光信号强度要明显高于mock组以及LASP1-S198A组。6.Western blot结果表明磷酸化的LASP1可以促进食管鳞癌细胞EMT的发展。7.磷酸化的LASP1可以增加Snail半衰期,提高Snail的表达水平。结论1.PAK4可以磷酸化LASP1丝氨酸198位点。2.磷酸化的LASP1可增加Snail的稳定性,通过EMT促进食管鳞癌的侵袭和转移。