现代战争中各种火器的强大动能极易导致周围神经缺损,平时周围神经损伤则常见于交通事故、肿瘤切除、炎性疾病、先天性畸形等因素。缺损性周围神经损伤不仅难以修复,也给病人及社会带来沉重负担。与再生能力低下的中枢神经系统损伤相比,长度小于0.5cm的周围神经缺损可采用神经吻合术进行处理,预后往往较好。当神经缺损大于4cm时则首先采用自体神经移植进行修复,但以自体神经为供体不仅来源受限、匹配困难,也存在很多后遗症,且修复效果也并非尽如人意。同种异体神经虽已开展临床应用研究,但修复效果远不如自体神经,亦存在免疫排斥问题。近年来快速发展的组织工程神经技术为神经缺损修复带来了新希望,其优点在于:一是可以作为自体神经和同种异体神经的替代物,二是可以修复更长的神经缺损,三是可以根据神经缺损长度和直径“量身定做”。虽已有少量组织工程神经用于临床,但存在神经再生缓慢、神经结构和功能恢复欠佳等问题。从以往组织工程神经及其修复周围神经缺损的研究来看,目前学者正从以下几个方面对组织工程神经技术进行改进:一是支架材料的合成、筛选与神经导管制作,目前认为PLGA是较为理想的支架材料;二是选择更适宜的种子细胞,以往曾用种子细胞有ESCs、NSCs、BMSCs、ADSCs、DPSCs、SCs、OECs等多种,表皮神经嵴干细胞(Epidermal neural crest stem cells,EPI-NCSCs)易于获取、自我更新能力强、且具有多向分化、分泌神经营养因子、致瘤风险低等优点,显示了较好的应用前景;三是选择更优秀的细胞外基质,以强化移植修复过程中对神经再生的诱导和促进作用。同时,人们还发现,炎性免疫反应对于神经缺损的修复有十分重要的影响,这也成为近年研究的一个热点,对其进行探讨将有助于从机制上突破现有神经缺损修复的困境。炎性免疫反应在组织创伤修复过程中具有重要作用,深刻影响着神经再生的病理生理过程。炎性免疫反应是由免疫活性细胞和炎性细胞因子构成的复杂网络,近年来人们逐渐认识到巨噬细胞是这一网络中关键的免疫活性细胞,它在神经缺损修复过程中既能向M1型极化从而产生神经毒性,也能向M2型极化而利于神经损伤修复。目前认识到炎性细胞因子主要有两类,一类是促炎因子,如IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ等,可加剧炎性反应;另一类是抗炎因子,如IL-4、IL-10、IL-13、TGF-β1等,则可以抑制炎性反应。本研究在课题组既往建立的人工神经制备方法基础上,提出以EPI-NCSCs这样一种从自体毛囊获得的神经干细胞,结合PLGA支架及ECM细胞基质构建出新型组织工程神经,观察其桥接移植的修复效果,并着重从其对炎症反应调控的角度,研究其作用机制。首先将新型组织工程神经桥接于大鼠坐骨神经(Sciatic nerve,SN)缺损处(缺损总长度为15mm,该长度相当于人体神经缺损12.8-14.2cm)。再于桥接后9周内分别采用不同指标,观察新型组织工程神经在移植修复过程中对巨噬细胞的极化状态、炎性因子表达变化的调控及其对于缺损坐骨神经结构和功能的修复作用。拟解决的关键科学问题是:新型组织工程神经对局部神经组织内的巨噬细胞极化是否具有调节作用?新型组织工程神经能否调控局部炎性细胞因子的表达?调控后的炎性免疫微环境是否更有利于周围神经缺损的移植修复?材料与方法1.EPI-NCSCs培养与组织工程神经制作及坐骨神经桥接(1)细胞培养:EPI-NCSCs取自GFP转基因大鼠毛囊中,用DMEM/F12/FBS/bFGF培养液原代培养,PBS液洗涤覆有细胞的载玻片后,用Nestin/SOX10一抗工作液4℃孵育过夜,PBS漂洗后用Cy5-IgG/Alexa-Flour-594-IgG二抗工作液37℃避光孵育,然后计算SOX10+/Nestin+细胞数量。(2)PLGA支架:将PLA/PGA按85/15的比例混匀后溶于三氯甲烷制备5%溶液,玻璃培养皿中蒸发形成厚约25um的PLGA膜,然后卷膜制成PLGA导管,γ射线照射灭菌,用前以DMEM/F12浸润。(3)常规麻醉SD大鼠,暴露右侧坐骨神经,切除10mm坐骨神经,残端回缩形成长约15mm缺损。然后用PLGA导管套接于神经断端,注入25μL EPI-NCSCs/ECM,8-0缝线缝合断端,逐层缝合肌肉皮肤。2.调控巨噬细胞极化(1)免疫荧光鉴定:同上麻醉SD大鼠,暴露并取出长约20 mm坐骨神经,切为20μm冰冻切片,入TritonX-100 15分钟,山羊血清封闭1小时,用CD68/iNOS一抗(M1型巨噬细胞)和CD206/Arginase-1一抗(M2巨噬细胞)4℃孵育过夜,TRITC-IgG/FITC-IgG二抗避光孵育2小时,Hoechst33342细胞核染色,避光孵育30分钟。(2)成纤维细胞和SCs免疫荧光鉴定:SD大鼠麻醉后取出坐骨神经,制成20μm冰冻切片,用Vimentin一抗(成纤维细胞)和S-100一抗(SCs)孵育,二抗工作液为TRITC-IgG/FITC-IgG(1:200),细胞核用Hoechst33342染色。3.炎性细胞因子调节(1)Western-blot测定:将所取坐骨神经匀浆后提取总蛋白,然后定量蛋白浓度,再进行SDS-PAGE电泳、转膜,用IL-4/IL-6/IL-13/TNF-α/actin一抗孵育,再用辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG二抗孵育,PVDF膜曝光后用Image J图像分析软件测算条带灰度值,actin内参作对照。(2)免疫组化染色:SD大鼠麻醉、取出坐骨神经后制作4μm石蜡切片,脱蜡水化后经3%过氧化氢室温10分钟,山羊血清封闭1小时,用IL-4/IL-6/IL-13/TNF-α一抗过夜孵育,再用山羊抗兔/鼠IgG二抗孵育,链霉亲和素-过氧化物酶30分钟,DAB显色,光镜观察分析。(3)免疫荧光染色:SD大鼠麻醉、灌注固定、取出坐骨神经后后制作20μm冰冻切片,入0.3%TritonX-100室温15分钟,山羊血清室温封闭1小时,用IL-4/IL-6/IL-13/TNF-α一抗过夜孵育,二抗TRITC-IgG/FITC-IgG避光孵育2小时,Hoechst33342细胞核染色,荧光显微镜下拍照与分析。4.缺损坐骨神经修复(1)组织学观察:术后9周时麻醉、固定大鼠、取出坐骨神经行石蜡包埋,切4μm切片,HE染色,光学显微镜观察分析。(2)运动终板检测:术后9周取腓肠肌制作30μm冰冻切片,AChE染色,光学显微镜观察,Image ProPlus图像软件分析。(3)感觉功能评估:术后9周时将大鼠两侧后足浸入50℃热水中,记录两侧后足的回缩反射时间,痛温觉用LFRT表示。(4)运动功能评估:术后9周时记录大鼠后足足印迹,分别测量TS、ITS、PL,然后根据公式计算SFI。(5)神经电生理检测:术后9周时麻醉大鼠,暴露实验侧和正常侧坐骨神经,双钩状电极(极间距2 mm)刺激,双极针形电极记录,刺激间期0.25 ms,刺激强度10mA,刺激频率1Hz,每只大鼠重复记录5次,结果用PowerLab软件分析。(6)腓肠肌湿重恢复检测:术后9周时,麻醉大鼠后切取实验侧和正常侧腓肠肌,吸去血迹后立即用电子天平称重,结果以实验侧腓肠肌重量/正常侧腓肠肌重量×100%表示。5.统计学分析以SPSS(版本22.0)数据统计软件进行统计分析,以均数±标准差表示,以独立样本t检验进行组间比较,P<0.05表示存在显著性差异,P<0.01表示存在极显著性差异。结果1.从GFP大鼠毛囊中获得EPI-NCSCs,经SOX10和Nestin双标鉴定,其纯度高达99.23±2.1%,移植到缺损10mm坐骨神经后,至少在宿主组织内存活9周。所制作的PLGA导管管壁表面为网状结构,间有很多直径约6μm左右的微孔,从而为EPI-NCSCs粘附生长提供了结构基础,也为种子细胞获得环境营养提供了结构保障。2.组织工程神经桥接坐骨神经缺损后1周,可明显提高M2巨噬细胞的比例,降低M1巨噬细胞的数量。桥接后3周时,有利于神经再生的SCs数量和活性被显著提高,而阻碍神经再生的成纤维细胞数量和活性则被明显降低。在所用组织工程神经各成分中,种子细胞EPI-NCSCs在这些有益效应中发挥了关键作用。3.组织工程神经桥接坐骨神经缺损后1、3、7、14、21天,Western-blot、免疫荧光和免疫组化实验证实,宿主组织抗炎因子IL-4和IL-13的表达呈逐渐增强的趋势,而促炎因子IL-6和TNF-α则呈逐渐下降的趋势。抗炎因子水平的提高和促炎因子水平的下降,为坐骨神经损伤后的神经纤维再生提供了更适宜的炎性免疫微环境。4.术后9周时,形态组织学观察证实组织工程神经桥接恢复了缺损坐骨神经的连续性,且神经直径更粗,组织结构更致密,神经纤维成分更多,运动终板数量更多体积也更大。LFRT测定表明感觉功恢复更好。SFI评估显示明显提高了运动功能的恢复水平。与此同时,肌肉湿重恢复率明显优于对照组动物。神经电生理检查证实电位的潜伏期缩短,电位幅度提高,说明神经传导速度更快,对刺激反应更强。结论本研究制备的组织工程神经中的种子细胞EPI-NCSCs至少可在宿主组织内存活9周。组织工程神经在移植过程中一方面促使宿主组织内巨噬细胞向M2型极化,促进抗炎因子(IL-4,IL-13)表达,增加有利于神经纤维再生的SCs数量;另一方面降低M1巨噬细胞的数量,抑制促炎因子(IL-6,TNF-α)的表达,降低抑制神经纤维再生的成纤维细胞数量。组织工程神经调控的局部炎性免疫微环境提高了长节段缺损坐骨神经结构与功能的恢复水平。