目的:目前,全球范围内数百万青少年及成年人正在遭受软骨缺损带来的伤痛,由于缺损的软骨自我修复能力差,移植后与周围正常软骨整合效果欠佳使得软骨缺损修复仍然是艰巨的任务与挑战。软骨组织工程3D生物打印是软骨缺损修复方法中的很有前景的治疗,选择合适的生物材料和种子细胞可以有效实现软骨再生修复缺损。然而,生物相容好、力学强度可、可生物降解、可打印的生物材料非常有限。本研究通过使用甲基丙稀酸酐(MA)对黄原胶(xanthan gum.XG)改性成可紫外光交联水凝胶黄原胶甲基丙稀酸酸(XGMA),XGMA封装骨髓间充质干细胞(BMSCs)通过3D生物打印技术,经紫外光(365nm)交联形成水凝胶,探索骨髓间充质干细胞在水凝胶中的生长、软骨分化及软骨缺损修复的情况。方法:制备黄原胶水溶液,使用甲基丙烯酸酐对黄原胶进行羟基修饰,得到高、低甲基丙烯酸酐接枝率的黄原胶甲基丙稀酸酯(XGMA0.5、XGMA2),使用核磁氢谱检测改性的黄原胶验证其化学结构,用未做改性的黄原胶作为对照。分别制备几种浓度不同的XGMA水凝胶前体,通过打印,筛选出打印成型好、结构分辨率高、所需空气压力小的XGMA打印浓度。测定打印支架的各种理化性质,包括电子显微镜观察水凝胶冻干后的孔径大小,力学检测仪测定打印后支架经紫外交联后0时、24小时水凝胶的压缩模量,以PBS(PH=7.40)缓冲液模拟体内环境测定不同时间点水凝胶支架降解率和溶胀率。我们选择力学强度高的高接枝度的XGMA2进行体内、外实验,体外实验根据材料分为,海藻酸钠组(Alginate),胶原组(collagen),黄原胶铁离子组(XG-Fe3+),XGMA2组。本研究选用刚出生3天的新西兰幼兔骨髓间充质干细胞作为种子细胞,各组材料封装BMSCs通过3D打印。在含10ng/ml白介素-6(interleukin 6,IL-6)的培养基中孵育24小时,使用DCFH-DA荧光探针检测细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)。在含10ng/mlTGF-β的培养基中分别孵育1周和2周,使用活/死染色共聚焦检测和观察细胞的存活率及细胞在水凝胶中的生长情况。分别测定水凝胶支架内DNA含量及分泌的粘多糖(Glycosaminoglycan,GAG)含量。荧光定量PCR(qRT-PCR)检测软骨的标志基因SOX-9,COL2A1,ACAN,肥大标志基因COL10A1,纤维化标志基因COL1A1。免疫荧光染色在荧光显微镜下观察软骨特异性蛋白II型胶原蛋白的表达。体内实验是将打印的含BMSCs水凝胶支架植入兔膝关节软骨缺损处,移植后3个月收样,通过肉眼观和切片染色根据国际软骨修复协会(ICRS)评估各组缺损修复情况。组织学分析包括HE染色观察组织结构形态、番红固绿染色检测细胞GAG分泌量,免疫组化检测软骨特异性蛋白II型胶原蛋白的表达。结果:我们成功使用甲基丙烯酸酐取代黄原胶的醇羟基获得了 XGMA,接枝率可以通过调整MA的投入量以制备高、低接枝率的XGMA(XGMA0.5、XGMA2),根据核磁氢谱计算XGMA0.5、XGMA2的接枝率大约分别是4.3%和15.3%。制备的2%、3%和4%XGMA三种浓度水凝胶前体筛选打印浓度,发现浓度为4%XGMA打印出来的水凝胶支架塑形胶好,分辨率高,用于后续的体内外实验。XG-Fe3+、XGMA0.5和XGMA2之间的理化特点存在差异,研究发现黄原胶与Fe3+交联是可逆的,这与文献报道是一致的,而光交联组是不可逆的,所以XG-Fe3+的溶胀率明显高于其他组。电镜观察XG-Fe3+表面没有明显的间隙,XGMA则形成相对均匀的空间网络结构,孔径大小受MA的接枝率的影响,接枝率越大,其发生交联的密度就越大,孔径就越小。接枝率低的交联密度高,孔径就大。力学强度检测发现,XG-Fe3+水凝胶0时压缩模量最高为726 KPa,XGMA0.5压缩模量为52kpa,XGMA2的压缩模量为187KPa。XG-Fe3+水凝胶在培养基孵育24小时后压缩模量迅速下降到1.7kpa,XGMA0.5压缩模量为41kpa,XGMA2的压缩模量为152kpa。为期60天的体外降解实验发现XGMA0.5组降解了 75%,而XGMA2体外降解了 45%。DCFH-DA荧光探针显示荧光强度分别为最低的为XG-Fe3+、XGMA2,间接提示两组抗氧化能力强。活死细胞检测显示各组材料内细胞存活率无明显差异。qRT-PCR结果表明第7天XGMA2组的Sox9,Co12a1和ACAN等软骨标志基因表达量明显升高,分别相当于对照组的5.5,78.7和3.7倍,同样,第14天XGMA2组的Sox9,Co12a1和ACAN等软骨标志基因表达量相当于对照组的7.7,194.3和6.6倍,而肥大标志基因COL10A1和纤维化标志基因COL1A1的7天和14天表达都明显受到抑制。免疫组化显示:XGMA2组Ⅱ胶原蛋白的表达和平均细胞分泌GAG含量都高于胶原组和XG-Fe3+组。移植后3个月收样的兔膝关节,各组标本肉眼观没有发现明显的滑膜增生和炎症改变,对照组缺损修复效果不明显,XG组主要为纤维组织再生,表面有裂纹,XGMA2组和胶原组可以观察到透明软骨组织形成,与周围正常软骨组织整合可,大体评分从高到低依次为:XGMA2>胶原组>XG-Fe3+>对照组,组织切片染色可以观察到对照组有一薄层的纤维组织修复,与周围组织整合差。XG-Fe3+组圆形软骨细胞小于75%,主要为纤维软骨修复。XGMA2组和胶原组两组均可见透明软骨及少量稀松分布的软骨馅窝细胞形成,尤其是XGMA2组更为突出,修复p<GAG分泌均匀,含量与正常组织无明显差异,修复面无明显的裂纹,并与正常组织整合良好。XGMA2组、胶原组、XG-Fe3+组和对照组的组织学评分依次为:32.0,29.3,20和4.7分。Ⅱ型胶原蛋白免疫组化结果显示,对照组缺损修复区主要是阴性染色。胶原组缺损修复区接近表面上部为弱阳性染色,中下部为阳性染色,XG-Fe3+组缺损修复区弱阳性染色,XGMA2组阳性表达较其他组更强,与正常组织无明显差异。结论:高粘稠度使得它具有可打印性,剪切变烯性能使细胞通过3D针头时剪切力变小从而避免细胞损伤,因此它尤其适合用在3D打印领域。本实验证实XGMA作为生物墨水封装BMSCs三经3D打印可在体内外可诱导成软骨分化并修复缺损。其机械性能和孔径大小可通过调整MA的接枝率来调节以满足组织工程各种不同的需求。因此,黄原胶基生物材料在软骨组织工程中有多的潜在的应用,它将会在生物医学领域有更进一步的应用。