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瞬时感受器电位(transientreceptorpotential,TRP)是近年来发现的主要与感受功能有关的膜通道蛋白家族,主要包括TRPC、TRPV、TRPM等。TRPV4(又称VR-OAC、VRL2或OTRPC4)是TRPV家族成员之一。TRPV4是瞬时感受器电位的野香草受体亚家族(TRPV)的成员之一。在离体建立的细胞表达系证明,TRPV4通道具有温控特性,可被27℃以上的温热刺激激活,并可产生一个较强的钙离子内流。
褐色脂肪组织(brownadiposetissue,BAT),是哺乳动物体内非战栗性产热的主要来源。BAT的主要功能是通过非战栗性产热维持动物的体温及能量平衡。
下丘脑视前内侧核(medialpreopticnucleus,MPO)对支配BAT的交感神经节前神经元的活性存在紧张性抑制作用,进而调控BAT产热活动。但其作用的生物学机制还不清楚。在下丘脑体温调节中枢MPO存在有TRPV4,该通道具有温度感受特性,我们推测TRPV4可能通过影响MPO神经元活动,继而影响BAT产热活动,参与体温调节过程。
本实验旨在探讨下丘脑视前内侧核的TRPV4参与体温调节的中枢机制。应用冷暴露制作大鼠BAT产热增加的模型,结合在MPO给予TRPV4特异性激动剂4αPDD或特异性阻断剂RN1734,观察其对体温BAT产热活动的影响。
方法：
1、实验动物及处理
(1)实验动物及分组
选用健康雄性SD大鼠,体重220～250g,基础体温(38.1±0.2)℃,由中国医科大学实验动物中心提供。将动物随机分为6组:正常对照组(N)、单纯冷暴露组(C)、4αPDD组(P)、4αPDD+冷暴露组(P+C)、RN1734组(R)、RN1734+冷暴露组(R+C)。
(2)大鼠MPO插管和体温测量发射子植入
下丘脑MPO插管:将大鼠用10％水合氯醛(3ml/kg)腹腔麻醉,然后将其头部固定于立体定位仪上,暴露前囟。参照大鼠脑图谱,向下丘脑MPO(B:0mm;L/R:1.5mm;V:8.3mm)与矢状面成10°夹角,两侧分别插入一不锈钢管,并留置与之相匹配的针芯,用牙托水加牙科水泥固定。
检测插管位置:实验结束后,在MPO中微量注射液体染料亚甲蓝1ul。随后用4％多聚甲醛经大鼠心脏灌流,取出经多聚甲醛固定的大脑。将其置于30％蔗糖溶液中脱水后,制备冰冻切片,显微镜下观察插管位置。
体温遥测发射子植入:在麻醉状态下,于大鼠腹腔植入遥测系统发射子。术后动物单笼饲养,恢复一周后进行实验。
2、体温测量
应用BW-200生理无线遥测系统测量大鼠体温。实验前一日早上8时开始记录大鼠基础体温,每隔30分钟测量体温1次,共测量6小时,取其平均值记为基础体温。实验均在早8时开始,各组在相应处理后开始监测体温变化,每隔5分钟自动记录体温一次,直到实验结束。
3、下丘脑MPO细胞内钙离子浓度([Ca2+]i)测定
采用日立F-4500型荧光双波长分光光度计测定。
4、下丘脑MPO中TRPV4表达测定
(1)Westernblot检测下丘脑MPO中TRPV4表达。对照选用抗β-肌动蛋白抗体(β-actin)。目的蛋白与相应β-actin蛋白的灰度比值作为该目的蛋白的相对表达量。
(2)免疫荧光检测下丘脑MPO中TRPV4表达,荧光显微镜下观察并摄片。
5、BAT组织中UCP1mRNA表达测定
采用RT-PCR方法,扩增片段的长度为478bp。PCR产物经2％的琼脂糖凝胶电泳后,用凝胶成像分析系统进行基因表达水平分析。
6、大鼠BAT质量及BAT总蛋白含量测定
用Folin-酚法,以牛血清蛋白为标准,采用分光光度计测定BAT样品中的总蛋白质的浓度。
7、BAT中线粒体蛋白含量检测
提取BAT中线粒体,线粒体蛋白质定量用Folin-酚法,以牛血清蛋白为标准,采用分光光度计测定。
8、大鼠BAT中细胞色素C氧化酶(COX)活性检测
使用COX活性检测试剂盒(GENMED,USA)检测COX活性。
9、数据分析
所有实验数据均用均数士标准差((x)±s)表示,各组均数间差异的比较应用t检验,相关分析用相关性检验分析法。
结果：
与对照组(N)比较,单纯给予TRPV4特异性激动剂4αPDD组(P),体温无明显变化;BAT质量、BAT总蛋白含量和线粒体蛋白含量、UCP-1mRNA表达量、细胞色素C氧化酶活性均无明显变化;MPO中TRPV4表达增加,细胞内钙离子浓度升高。单纯给予TRPV4特异性阻断剂RN1734组(R),体温明显升高;BAT质量、BAT总蛋白含量和线粒体蛋白含量明显降低,UCP-1mRNA表达量、细胞色素C氧化酶活性明显升高;MPO中TRPV4表达降低,细胞内钙离子浓度降低。
与对照组(N)比较,单纯冷暴露组(C)的体温下降,且有统计学意义;BAT质量减少、BAT总蛋白含量和线粒体蛋白含量减少、UCP-1mRNA表达量增加、细胞色素C氧化酶活性增加;MPO中TRPV4表达略增加,但细胞内钙离子浓度降低。
与单纯冷暴露组(C)比较,预先给予4αPDD后进行冷暴露组(P+C),冷暴露时体温明显下降;BAT质量、BAT总蛋白含量和线粒体蛋白含量减少的幅度低于C组;MPO中TRPV4蛋白表达、细胞内钙离子浓度高于C组。预先给予RN1734+冷暴露组(R+C),冷暴露时体温明显高于C组;BAT质量、BAT总蛋白含量和线粒体蛋白含量减少的幅度高于C组;MPO中TRPV4蛋白表达、细胞内钙离子浓度均低于C组。
结论：
1、FRPV4特异性激动剂4αPDD或特异性阻断剂RN1734,能分别诱导或抑制通道在细胞膜上的表达。
2、在下丘脑MPO区给予4αPDD或RN1734,分别能增加或减少细胞内钙离子浓度。
3、在下丘脑MPO区给予4αPDD或RN1734,在冷暴露时分别能减弱或增加BAT产热活动。