研究背景：卵巢癌是妇科恶性肿瘤中首位致死性疾病。在理想的肿瘤细胞减灭术的基础上辅助铂类药物为主的联合化疗是临床规范的治疗手段。然而顺铂和卡铂作为最常用的一线化疗药物,其原发或继发耐药性的产生是卵巢癌治疗的主要障碍,也是晚期(Ⅲ或Ⅳ期)卵巢癌患者五年生存率较低(20～30%)的主要原因之一。目前对于铂类化疗药物抗肿瘤作用机制的研究已经较为深入,但对其耐药性产生机制的认识相对处于初级阶段,进一步预测铂类化疗耐药的工作则更是刚刚起步。早期对于铂类化疗药物耐药研究集中十调节耐药的基因及分子机制。近年来则更多的关注十铂类耐药的细胞外基质及新耐药相关蛋白的探索。本课题组自2003年起开展对卵巢上皮癌铂类化疗耐药相关蛋白的研究。运用比较蛋白质组学技术,筛选出5种铂类化疗耐药相关蛋白(Annexin A3、Destrin、IDHc、GSTO1-1和Cofilin 1),其中annexin A3因其在全部卵巢癌铂类耐药细胞中获得共表达,显著上调,成为本课题组进行铂类耐药研究的目标蛋白。经免疫组织化学验证,annexin A3在临床卵巢癌铂类耐药患者的肿瘤组织中表达明显升高,annexin A3高表达组的无瘤生存期显著缩短。动物试验表明,annexin A3高表达细胞,在顺铂作用后裸鼠成瘤率明显上升。进一步运用质粒转染技术,上调annexin A3的表达后,发现annexin A3能够降低细胞内铂含量及铂-DNA结合量。annexin A3高表达的细胞对铂类化疗药物的耐药性显著增强,但是对紫杉醇、表阿霉素等药物无交叉耐药性,提示annexin A3可能是铂类特异性耐药相关蛋白。此外,annexin A3降低卵巢癌细胞P53水平基于以上研究结果,本实验旨在探讨annexin A3成为临床卵巢癌铂类化疗耐药标记蛋白的可能性。在获得annexin A3稳定高表达或低表达的卵巢癌细胞系基础上,运用Western blot技术,检测卵巢癌细胞培养上清中annexin A3的表达。采用ELISA分析法检测annexin A3在临床卵巢癌患者血清中的表达,分析annexin A3外泌水平与卵巢癌铂类耐药的相关性。通过透射电镜及免疫电镜观察annexin A3表达上调及外分泌的形态学基础。进一步探讨annexin A3外泌的作用及其诱导细胞对铂耐药的生物学机制。研究方法：1、运用正义annexin A3质粒转染顺铂敏感卵巢癌细胞，获得annexin A3稳定表达上调的细胞克隆；同时运用反义annexin A3质粒下调顺铂耐药卵巢癌细胞内annexin A3水平，获得annexin A3稳定表达下调的细胞克隆。采用免疫荧光激光共聚交技术检测annexin A3表达水平的变化，以及在细胞内的定位。收集细胞培养基上清，采用免疫印迹技术检测培养基上清中annexin A3的表达，同时比较其外泌水平与细胞内annexin A3表达水平、细胞耐药性的关系。收集临床卵巢癌患者手术前血清50例，以ELISA法检测annexin A3在人外周血中的表达水平2、采用Signal-P等软件分析annexin A3的分子结构。透射电镜观察卵巢癌铂类耐药细胞内超微结构的特征，以及运用siRNA瞬时下调顺铂耐药卵巢癌细胞内annexin A3表达水平后对于细胞形态的影响。以胶体金标记annexin A3蛋白，运用免疫电镜观察annexin A3在亚细胞器中的定位。进一步收集annexin A3高表达的细胞培养基上清，分别采用小量提取法和梯度离心法收集细胞培养基上清中的exosome,选择适合本实验的exosome收集方法。根据exosome所含蛋自质浓度对各卵巢癌细胞系分泌的exosome进行定量，观察annexin A3对exosome分泌数量的影响。3、利用电感耦合等离子质谱法分别检测细胞内、细胞培养上清中、以及exosome内的铂含量。以CDDP至终浓度10μM分别作用卵巢癌铂类敏感、耐药、分别转染正反义质粒、以及siRNA下调annexin A3表达的细胞，于不同时间点收集细胞，观察annexin A3对卵巢癌细胞铂吸收的影响。以CDDP至终浓度10μM分别作用上述细胞36小时，更换无药无血清培养基，于不同时间点收集细胞，观察annexin A3对卵巢癌细胞铂外流的影响。以CDDP至终浓度10μM分别作用上述细胞24小时，更换无药无血清培养基继续培养24小时。梯度离心法收集细胞培养基上清中的exosome,分析其中的铂含量4、收集临床卵巢癌患者手术前血清50例，术后正规随诊至少1年。将所有卵巢癌患者分为铂类化疗耐药组和敏感组，同期收集本院体检中心正常妇女血清30例作为对照。运用ELISA法检测卵巢癌患者及正常妇女血清中的annexin A3表达水平，探讨外分泌蛋白annexin A3预测卵巢癌耐药的敏感性和特异性。同时运用生存分析方法绘制Kaplan-Meier曲线，分析血清中annexin A3蛋白表达水平与卵巢癌患者无瘤生存期的关系。研究结果：1、体外实验表明，卵巢上皮癌顺铂敏感细胞系(SKOV3和A2780)和耐药细胞系(SKOV3/Cis和A2780/Cis)在分别转染正义和反义annexin A3质粒后，敏感细胞内annexin A3表达水平稳定上调，耐药细胞内annexin A3水平稳定下调。蛋自表达水平变化主要表现在胞浆内annexin A3水平的改变，胞核内无显著表现，胞膜无annexin A3表达。卵巢癌细胞培养上清中可以检测出annexin A3的表达，其中细胞内annexin A3高表达的细胞培养基上清中annexin A3的水平也增高，细胞内annexin A3低表达的细胞培养基上清中annexin A3水平也相应降低；顺铂耐药细胞可以释放高水平的annexin A3体内实验表明，在卵巢癌患者的外周血中可以检测到annexin A3的表达，呈非正态分布。2、运用Signal-P软件分析annexin A3分子结构，发现annexin A3小具备典型信号肽结构，表明annexin A3蛋白分子不通过经典信号肽途径分泌出胞。透射电镜观察到，在卵巢癌铂类耐药细胞的胞浆内多囊泡小体结构增多，囊泡小体内含大量颗粒样物质，在细胞膜附近囊泡有与细胞膜融合并脱离细胞的趋势。经siRNA瞬时下调卵巢癌顺铂耐药细胞内annexin A3的表达后，胞浆内的囊泡样结构构明显减少。免疫电镜发现，在这些囊泡小体内及其表面存在胶体金标记的annexin A3蛋白。从Annexin A3高表达的细胞培养基上清中提取到exosome。透射电镜观察exosome呈圆形或椭圆形，直径为40～100 nm。免疫电镜及Western blot的结果均证实exosome中有annexin A3表达。定量实验表明，每106个顺铂耐药细胞(SKOV3/Cis)在24小时内可分泌出3.985±1.194μgexosomes,而同等数量的顺铂敏感细胞(SKOV3)在24小时内仅分泌出0.525±0.214μgexosomes (P=0.02)。运用质粒转染技术,将顺铂敏感细胞(SKOV3)内annexin A3表达稳定上调后,每106个细胞在24小时内可分泌出2.971±0.35μg exosomes,与转染前相比exosome量显著上升(P=0.001)。顺铂耐药细胞(SKOV3/Cis)内annexin A3急定下表达后,每106个细胞在24小时内仅分泌出1.447±0.899μgexosomes,差别显著(P=0.004)。A2780系列卵巢癌细胞也表现了同样的趋势。3、检测细胞内铂含量变化,在顺铂作用的8小时内,卵巢癌铂类敏感、耐药、分别转染正反义质粒、以及siRNA下调annexin A3表达等各株细胞对铂吸收的速度没有明显的差别。检测细胞培养上清中的铂含量变化,与顺铂耐药的细胞相比,siRNA下调annexin A3表达后,细胞对铂的释放速度在8h内明显增快,24h时间点的上清内含铂量显著上升。同样,转染正义annexin A3贡粒后,顺铂敏感细胞在药物作用后,对铂的释放速度在8h内明显上升,24h时间点上清内含铂量上升,表明annexin A3能够提高卵巢癌细胞对铂的外流速度。进一步的研究发现,在exosome内检测到铂离子。上调细胞内annexin A3表达后,顺铂敏感细胞exosome携带铂的含量明显升高(P=0.004);下调细胞内annexin A3表达后,顺铂耐药细胞exosome携带铂的含量明显降低(P=0.028)。4、ELISA法定量的结果表明,正常妇女组血清annexin A3表达水平为0.8590±0.0744 ng/ml(n=30),卵巢癌患者血清annexin A3表达水平为1.6898±2.6563 ng/ml(n=50),运用Mann-Whitney U检验方法检验,差别其有统计学意义(P<0.0001)。前瞻性随诊50例卵巢爱患者,根据临床评价铂类耐药的定义,30例为铂类化疗耐药患者,20例为临床铂类敏感患者。耐药组和敏感组annexin A3表达水平分别为2.1145±3.3833 ng/ml和1.0528±0.1178 ng/ml,两组差别具有显著统计学意义P=0.0009。以1.13 ng/ml为界值,annexin A3预测卵巢癌患者铂类化疗药物耐药的敏感性63%,特异性达到80%。血清annexin A3高于1.1 3 ng/ml的患者无瘤生存期显著缩短(P=0.009<0.05)。结论1、Annexin A3蛋白主要在卵巢癌细胞的胞浆内表达,在胞核内无显著表现,在胞膜无表达。在卵巢上皮癌细胞系的培养基上清中检测出annexin A3蛋白表达,其强度与细胞内annexin A3的表达水平呈止相关关系。进一步的体内实验在临床卵巢癌患者的外周血中检测出annexin A3蛋白的表达,充分证实annexin A3是一个可分泌蛋白。2、Annexin A3蛋白质分子结构中不具备典型信号肽结构,不能经过经典的信号肽途径分泌。经过透射电镜和免疫电镜的分析,annexin A3蛋白在卵巢癌耐药细胞内的表达明显上调后,观察到在细胞浆内大量囊泡样结构的形成,囊泡样小体与细胞膜的融合及分离,进而在细胞培养上清中发现表达annexin A3蛋白的exosome小体,exosome的定量与胞浆内annexin A3的表达水平呈正相关。上述研究结果揭示出annexin A3出胞完整的生物学过程,即细胞浆内annexin A3的表达上调致使大量囊泡样结构的聚集,形成囊泡样小体,小体与细胞膜融合脱离,继而以exosome的形式完成annexin A3蛋白的外分泌。3、Annexin A3蛋白外泌与调节卵巢癌细胞对于铂类耐药的相关性。本实验证明,Annexin A3蛋白的表达上调对于卵巢癌细胞对铂的吸收过程没有明显的影响,但细胞对于铂的释放显著增加。对exosome内铂浓度的测定结果表明,annexin A3蛋白外分泌过程将铂离子带出细胞外,从而使铂类药物不能与卵巢癌细胞的DNA相结合,产生耐药性。4、小样本的临床研究表明,正常妇女组血清annexin A3表达水平低于卵巢癌组；临床化疗敏感卵巢癌患者血清中annexin A3的表达低于化疗耐药组。进一步证明annexin A3是一种卵巢癌铂类耐药标记蛋白。基于卵巢癌患者的血清样本取自化疗前,初步计算其预测铂类耐药的敏感性和特异性均可以达到50%以上,深入探讨annexin A3蛋白成为临床卵巢癌铂类耐药预测蛋白的可能性研究势在必行。