目的:细胞膜穿透肽是一类可以通过直接穿膜或胞吞的方式穿透细胞生物膜屏障的,大约为5～55个氨基酸残基长度的多肽,因其能够通过共价键结合或络合多种类型的药物、微粒进入细胞内部发挥药效,而在近年来成为药物递送系统中一个重要研究对象。HMGB4蛋白作为高迁移率族蛋白HMGB家族中最新发现的一员,其拥有特的HMG-box DNA结合域,能非特异性地结合DNA分子;其氨基酸序列中富含精氨酸、赖氨酸等碱性氨基酸残基,带正电荷;在结构上由box A和box B串联而成,与HMGB家族其他成员相比缺乏酸性尾部。研究表明HMGB蛋白作为核蛋白,在生理状态下发挥DNA结合和转录调节作用,而在细胞发生炎症或坏死时可通过主动分泌或被动漏出到细胞外,结合靶细胞表面TLR等模式识别受体引发一系列炎症信号转导。我们对HMGB蛋白家族成员的胞内转运产生兴趣,拟探索HMGB蛋白是否具有穿过细胞膜的能力,为进一步的HMBG应用提供实验依据。HMGB4作为高迁移率族蛋白家族新成员,很多功能尚不明确并存在更多研究潜力,本研究运用生物信息学技术对HMGB4进行系列分析,筛选出候选CPPs并进一步生物信息学分析和评估,然后通过培养细胞验证其细胞膜穿透能力。方法:(1)通过生物信息数据分析来预测具有穿膜能力的HMGB4蛋白片段,本研究通过对肽的氨基酸分子组成、等电点、亲水性、可溶性、表面带电荷量、氨基酸二级结构分析、氨基酸残基柔韧度和促进无序性等性质的多个方面数据分析,及多种CPPs预测软件的评估,更全面准确来预测CPPs。通过统计数据分析预测全长为181bp的HMGB4-Box A-C末端的一段含有十个氨基酸残基的肽段(81～90)(简称box A-C)很可能具有穿膜能力,后面将结合实验方法进一步验证其穿膜效率。(2)结合细胞实验,成带有荧光标记的box A-C-FITC、NCO-FITC短肽,将box A-C、NCO等与细胞体外共孵育,通过荧光显微镜观察细胞内荧光分布,通过设置box A-C的浓度梯度、与细胞孵育的时间梯度、孵育的温度条件、DMSO的影响及与已知穿膜肽的对比,来检测box A-C在不同条件下细胞内荧光量的变化,进而反应其穿膜的效率。结果:(1)数据分析结果HMGB4-box A蛋白的C端一段10个氨基酸组成的多肽很可能为一种新的CPPs,其氨基酸序列为:KRRKRRKRDP,富含碱性的精氨酸和赖氨酸,为一种阳离子多肽,肽表面大面积分布的正电荷,有利于与带负电的细胞膜静电吸附,通过对20种氨基酸的促无序或有序倾向及柔韧性或刚性分析,HMGB4-box A-C肽中含有的精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸和脯氨酸都是促进无序和柔韧性较好的氨基酸,尤其是精氨酸和赖氨酸,而有报道称CPPs数据库中统计结果CPPs结构上更偏向于无序,这可能更有利于它们的穿膜,而CPPs更偏柔韧的特质也加强了它能灵活透过凝脂双分子层的能力。有研究证明CPPs氨基酸的二级结构多以无规则卷曲coil结构和α-螺旋结构形式存在,而数据表明HMGB4-box A-c肽氨基酸二级结构以coil类形式存在。对该肽水溶性的预测可能暗示着它的穿膜机制很可能是直接扩散。(2)对HMGB4-box A-C肽的细胞实验验证结果显示不同浓度的box A均能穿透细胞膜进入细胞内,在一定浓度范围内(2.5μM～10.0μM)细胞内荧光量随着浓度增加而增多;在一定时间范围内(0.5h～2.0h),细胞内荧光量随着随着时间延长而增多。5%DMSO可以明显提高box A的穿膜效率;在37℃、16℃、4℃不同温度下穿膜效率随温度的降低穿膜效率显著提高,表明穿膜机制可能是不依赖能量的直接扩散,且低温下膜的通透性增加可能促进了穿膜效率。结论:通过生物信息学结合细胞实验验证成功发现了一种新的效率较高的细胞膜穿透肽:HMGB4-Box A-C。