研究目的本研究采用针刺干预宫内窘迫缺氧缺血性脑损伤(HIBD)模型大鼠的随机对照实验方法,旨在从大鼠脑组织海马区活性氧簇(ROS)和NIX蛋白的表达以及线粒体ATP/ADP比值变化着手研究针刺“靳三针”头针穴组对HIBD模型大鼠自噬表达和氧化应激以及能量代谢的影响与神经元功能修复的作用机制。为临床治疗HIE患儿提供确切的理论依据。研究方法实验一:实验条件与方法:由广东省医学实验动物中心提供[许可证号:SYXK(粤)2013-0002]的SPF级SD大鼠20只,雌性;10只,雄性。体重:雌性230-270g,雄性400-450g。常规检疫3天,按雌:雄1:1合笼配种12h。雌性大鼠于次日早晨查阴道栓,以观察到阴道栓为妊娠第0天,连续配种3天。最后配种得孕鼠10只,其中正常分娩鼠2只,剖宫产大鼠4只,代乳鼠2只,备用鼠2只。在怀孕大鼠妊娠期21天、腹部明显可摸到胎鼠时采取夹闭双侧子宫动脉10分钟的延迟剖宫产手术。实验分组:造模成功的仔鼠以代乳母鼠进行哺乳喂养,针刺前随机将造模成功的仔鼠分为模型组和模型针刺组;自然分娩的仔鼠随机分为正常组和正常针刺组,每组8只,一共4组。干预手法:针刺组每日给予靳三针头针穴组针刺干预,每日针刺1次,每次每穴捻转行针10次后出针,不留针。一共干预14天。模型组和正常组每天同一时间行空抓,降低人为固定造成的差异影响因素。指标检测:各组大鼠每周称重一次并记录。取材时冰上低温全脑取材,钝性分离各部分组织、标记及称重。流式细胞术检测海马ROS平均荧光强度;蛋白免疫印迹检测海马NIX蛋白的表达。研究结果(一)体重:实验结果表明,与正常组相比,正常针刺组大鼠体重在d13-d35没有显著差异(P>O.05),模型组大鼠体重在d13-d35差异有显著性(P<0.01),模型针刺组大鼠体重在d13-d21有差异且具有统计学意义(P<0.01),模型针刺组大鼠体重在d28-d35有差异但不具有统计学意义(P>0.05);与模型组相比,模型针刺组大鼠体重在d21-d35有增加,差异无统计学意义(P>0.05)(二)行为学检测:1.旷场试验:通过对比正常组、正常针刺组、模型组与模型针刺组之间的活动次数,正常组与正常针刺组活动次数较高且两组无明显差异(P>0.05),模型针刺组和模型组活动次数均低于正常组,差异有统计学意义(P0.05);与模型组比较,模型针刺组大鼠活动次数优于模型组,差异具有统计学意义(P<0.05)。2.水迷宫试验(空间探索):比较各组大鼠的目的象限(第一象限)停留时间,与正常组比较,正常组与正常针刺组比较无明显差异(P>0.05),模型针刺组和模型组目的象限停留时间均短于正常组,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,模型针刺组目的象限停留时间较模型组的要长,差异有统计学意义(P<0.05)。(三)特异性指标1.各组ROS平均荧光强度表达检测结果:与正常组比较,正常针刺组与正常组之间差异不明显(P>0.05),模型组和模型针刺组ROS平均荧光强度表达均明显高于正常组,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组相比,模型针刺组大鼠的ROS平均荧光表达明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。2.各组NIX蛋白含量检测结果:与正常组比较,正常针刺组与正常组大鼠海马NIX表达差异不显著(P>0.05);模型组与模型针刺组均高于正常组,差异有统计学意义(P<0.05),与模型组比较,模型针刺组表达高于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。实验二:实验条件与方法:同实验一。实验分组:造模成功的仔鼠以代乳母鼠进行哺乳喂养至针刺前随机将造模成功的仔鼠分为模型+针刺组和模型组;自然分娩的仔鼠随机分为正常组,每组8只,一共3组。干预方法:同实验一。指标检测:分别于仔鼠出生第1天、14天(针刺前)、21天(针刺中)、28天(针刺后),透射电镜检测各组海马CA1区自噬情况;分别于出生第1天、28天(针刺后)高效液相反相色谱检测脑组织中ATP/ADP比值。实验结果:1.各组大鼠脑组织重量比较:第一天,正常组与模型组的脑组织重量比较无明显差异(P>0.05);第二十八天,与正常组比较,针刺组大鼠左脑皮质重量增加不显著(P>0.05),模型组左脑皮质重量增加显著减少(P<0.05);与模型组比较,针刺组左脑皮质重量明显增加,差异有显著性(P<0.05)。2.透射电镜:第一天,正常组镜下未见自噬体,模型组镜下可见较多肿胀破裂的线粒体散在分布,自噬体表达比正常组增多,神经元细胞核轮廓不饱满,细胞质分布不均匀;第十四天,针刺前,正常组和模型组镜下可见神经元,但自噬表达增多不明显;第二十一天,针刺干预7天后,正常组自噬表达不明显,模型组有少量自噬体,线粒体肿胀明显,神经元细胞核出现核周间隙增宽,针刺组镜下自噬体数量多于其余两组;第二十八天,针刺干预14天后,各组的自噬的表达增多不明显,针刺组镜下可见线粒体形态趋向正常状态,内嵴清晰排列,胞质分布均匀。3.高效液相色谱检测脑组织中ATP/ADP比值:第一天:正常组的ATP/ADP比值要高于模型组,差异有统计学意义(P<0.05);第二十八天,与正常组相比,针刺组低于正常组,与模型组相比,针刺组高于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论1.针刺能促进HIBD模型大鼠脑组织重量增加。2.针刺能改善HIBD模型大鼠的学习和记忆能力。3.针刺靳三针头针穴组可使已经下降至低表达的自噬再次升高,但仅维持在针刺干预的早期,针刺干预后期对促进自噬的再次表达作用不明显。4.针刺组中ROS与ATP/ADP比值表达成负相关趋势,提示针刺靳三针头针穴组促进缺氧缺血性脑损伤HIBD模型大鼠脑功能修复作用机制可能与针刺靳三针头针穴组能有效降低HIBD模型大鼠脑组织中的氧化应激损伤,并能提高HIBD模型大鼠脑组织线粒体能量代谢有关。