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流感病毒是重要的人类呼吸道病原体,可引起季节性流行和全球性大爆发。2013年3月,中国东部省份出现新型H7N9禽流感病毒,人们不禁担心H7N9是否会引起大范围疫情爆发。流感病毒的重要特点是能够对宿主细胞的各种通路进行调节,但是在病毒-宿主相互作用中的病毒成分和其作用机理却不是特别清楚。自噬是细胞内由膜介导的降解过程,双层膜自噬体的出现是自噬的重要标志。细胞质中的长寿命蛋白和受损的细胞器可通过自噬体被运输至溶酶体降解。自噬影响多种生理和病理过程如发育、癌症和感染性疾病。近年来研究发现,流感病毒感染可对自噬过程产生影响,流感病毒在体外和体内可引起自噬体堆积,但是流感病毒如何影响自噬和其作用机理仍然存在争论。我们利用流感病毒A/Hong Kong/8/68(H3N2)和A/WS/33(H1N1)感染细胞发现流感病毒可引起细胞自噬体标志物LC3-Ⅱ蛋白的大量堆积,通过荧光显微镜观察发现流感病毒也可以引起GFP-LC3融合蛋白的大量堆积。在所用的两株病毒中A/Hong Kong/8/68(H3N2)为金刚烷胺敏感株而A/WS/33(H1N1)为金刚烷胺耐药株。当用流感病毒M2蛋白离子通道抑制剂金刚烷胺处理流感病毒感染细胞时,金刚烷胺可抑制敏感型流感病毒引起的自噬体堆积但对耐药型流感病毒引起的自噬体堆积没有影响。流感病毒神经氨酸酶抑制剂奥司他韦对流感病毒引起的自噬体堆积也没有影响。这些结果表明,流感病毒引起自噬体堆积依赖于其M2蛋白离子通道活性。我们利用H5N1和H7N9流感病毒的M2蛋白来进一步研究M2蛋白离子通道活性是否可以引起自噬体堆积。金刚烷胺敏感型H5N1-M2(WT)和金刚烷胺耐药型H5N1-M2(S31N)蛋白表达后可引起自噬体堆积,但金刚烷胺只能抑制H5N1-M2(WT)引起的自噬体堆积而不能抑制H5N1-M2(S31N)引起的自噬体堆积。同样,H7N9-M2和其金刚烷胺敏感型突变体H7N9-M2(N31S)蛋白表达后也可以引起自噬体堆积,但金刚烷胺只能抑制H7N9-M2(N31S)引起的自噬体堆积而不能抑制H7N9-M2引起的自噬体堆积。结果表明,M2蛋白单独表达可以引起细胞自噬体堆积,且此过程与M2蛋白的离子通道活性直接相关。自噬过程除了出现具有标志性的自噬体外,自噬体还要与溶酶体融合形成自噬溶酶体才能完成整个过程。通过GFP-LC3融合蛋白和溶酶体标志分子LAMP2荧光共定位发现,M2蛋白引起的自噬体与溶酶体不能融合而形成自噬溶酶体。进一步研究发现,M2蛋白可引起自噬底物蛋白P62蛋白聚集在自噬体上,并且M2蛋白可通过其离子通道活性来抑制P62蛋白的降解。同样,流感病毒感染也可抑制自噬体与溶酶体融合而形成自噬溶酶体并抑制自噬底物蛋白P62蛋白的降解。这些结果表明,流感病毒M2蛋白可以抑制自噬溶酶体的形成并抑制自噬降解途径。流感病毒M2蛋白为H+离子通道蛋白,可定位于细胞内质网、高尔基体中并破坏这些内膜系统的PH值。研究表明,自噬体膜主要来自细胞内质网、高尔基体等内膜系统。我们利用荧光共定位发现,M2蛋白也定位于白噬膜上。因此,流感病毒M2离子通道蛋白干扰自噬溶酶体的形成可能是由于M2蛋白中和了自噬体内的PH值从而干扰了自噬体与溶酶体的融合。本研究中我们发现了M2蛋白离子通道活性在流感病毒引起自噬体堆积中的重要作用,并深入研究了M2蛋白作为重要的病毒成分如何抑制自噬溶酶体的形成并抑制自噬降解途径。这些发现将有助于我们进一步了解流感病毒与宿主的相互作用并可能为流感病毒预防(如H7N9)提供新的思路。