肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNFα)具有对某些恶性肿瘤的抑制或杀伤作用，也是致内毒素性休克、急性移植物抗宿主病及一些自身免疫病的重要效应因子，因此TNFα的改造和TNFα拮抗剂的研究受到各国学者的重视。重组TNFα及其拮抗剂(包括抗TNFα单抗、抗TNFα受体单抗、可溶性TNFα受体、TNFα突变体)均已应用于临床并取得了一定的治疗效果。但单抗的人源化、重组细胞因子或受体的纯化、不同程度的抗原性及价格因素等均成为上述制剂在国内应用的制约因素。近年来的研究发现，小分子细胞因子模拟物具有细胞因子受体激动剂或拮抗剂的作用，且小分子模拟物因容易合成并能够给予高浓度、可口服等优点使其具有更加广阔的研发与应用前景。筛选TNFα小分子模拟肽及结合肽对于TNFα研究具有重要的意义。本研究包括以下四个方面： 1、TNFα结合肽的研究：以rhTNFα为靶对噬菌体环七肽库进行筛选，以寻求可拮抗TNFα活性的小分子短肽。三轮筛选后，随机挑选23个噬菌体克隆经ELISA鉴定，其中11个克隆显示可与TNFα有较强的结合，DNA测序结果推导氨基酸序列，其中两个克隆的氨基酸序列为：c-ALWHWWH-c，另九个克隆序列为：c-(T／S)WLHWWA-c。竞争性抑制试验结果显示固相包被的TNFα与液相中的TNFα能够竞争与两种序列克隆结合，提示两种噬菌体克隆展示肽均为TNFα结合肽。 2、TNFα表位模拟肽的研究：以对TNFα结合肽的研究为基础，我们利用一株具有中和活性的TNFα单克隆抗体J1D9为靶筛选噬菌体环七肽库，研究TNFα表位模拟肽。在对噬菌体环七肽库进行三轮亲和性筛选后，随机挑选20个噬菌体克隆，ELISA鉴定出9个阳性克隆，经DNA测序推出三种氨基酸序列：c-RRPAQSG-c、c-NKHNRKI-c和c-RGMSRKI-c，其中优势克隆序列为c-RRPAQSG-c；鉴定结果显示阳性克隆能够与TNFα受体结合，并且能够阻断TNFα与受体的结合，提示筛选得到的环七肽克隆展示肽具有TNFα的抗原性及与TNFα受体结 第一军医大学顾士学位论文合的特性，为TNFa表位模拟肽。该模拟肽的研究为研制可成为抗内毒素休克等方面的小分于先导化合物或新型抑制剂提供依据。 3、以特异性噬菌体克隆为靶筛选肽库的研究——一种肽库筛选新方法的建立：为了深入研究细胞因于与配基（受体或抗体）相互作用的关键残基及其空间构象，在上述研究基础上，我们以TNFa表位模拟肽克隆为靶筛选噬菌体十二肽库，找寻与之结合的TNFa结合肽噬菌体克隆；并以此拓宽了噬菌体肽库的应用范围。在以噬菌体环七肽TNFa模拟肽克隆＊刁k－NA QSOC）为靶对噬菌体随机十二肽库进行H轮筛选后，挑取 20个克隆，经 ELISA鉴定有 10个克隆均与 T’NFa结合，测序结果显示它们均为同一氨基酸序列：EHMALTYPFRPP。此外，阻断试验和竞争抑制试验显示表达该序列的克隆与作为靶的LCS．7具有较高的结合活性，且能抑制LCS－7与受体的结合，由此推断该序列模拟TNFa配基（抗体或受体）表位与TNFa模拟肽结合，因此印证了分子间结合作用更多地取诀于几个关键性残基而不在于整个分子，同时也证实了这一筛选方法简捷、专一、特异的优点。 4、TNFa模拟肽克隆与TNFa结合肽克隆的计算机分子模拟 利用计算机辅助分子模拟技术对噬菌体十二肽 TNFa结合肽序列 LLT （EHMALTYPFRPP）与噬菌体环七肽 TNFa模拟肽序列 LCS－7 ＊－RRPAQSG《）以及TNFa分于间相互结合作用进行了模拟分析。将LLT序列提交SWISS－PROT进行同源模建，利用ACt。D。Ck程序将＊LT 18和TN F。进行对接，对两者间结合位点进行分析；在此基础之上，以 Insight 11软件构建 LCS刁分于三维结构，AutoDock程序对接LLT和 LCS－7两个短肽分子，找寻两者结合的关键性残基，结果表明LLT与TNFa及LCS－7分子间相互作用以静电相互作用为主，LCS刀和 TNFa活性部位的Arg在分于间相互作用中起重要作用。LLT18的关键氨基酸残基则为 Glul，HisZ，Met3和 T｝r7。此结果为TNFa抗原表位与受体或抗体结合的作用位点分析提供了重要数据，丰富了对TN F。单表位与其识别表位之间相互作用的认识。