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本研究以农杆菌菌株GV3101和LBA4404、质粒pCAMBIA1301、牡丹品种’凤丹白’试管苗叶柄诱导形成的愈伤组织为供试材料,进行了农杆菌表达载体的转化和牡丹愈伤组织遗传转化体系的初步研究。试验获得了转化农杆菌GV3101和LBA4404,进一步将GUS基因转入牡丹愈伤组织,于共培养后成功检测到GUS瞬时表达活性。同时对经筛选培养后得到的转化愈伤组织进行了 GUS组织化学检测,成功检测到GUS活性的表达。本试验为下一步转入其它功能基因奠定了一定的研究基础和技术依据。试验得到的主要结果及结论如下:1农杆菌表达载体的转化及菌株的筛选试验进行了质粒pCAMBIA1301 DNA的提取、农杆菌GV3101和LBA4404感受态的制备、质粒DNA对农杆菌的转化等一系列工作,成功的将质粒pCAMBIA1301转入农杆菌中,获得了含有GUS标记基因的农杆菌GV3101和LBA4404的表达载体。通过两个菌株侵染牡丹愈伤组织的一系列试验,结果表明,菌种GV3101自身毒性较强,抑菌较为困难,侵染愈伤后对牡丹愈伤生活力伤害较大,GUS组织化学染色后愈伤开始变红,且染色时间较长。LBA4404属于弱毒性菌种,侵染后对牡丹愈伤生活力没有明显影响,且有较高的转化效率。因此确定菌株LBA4404为适宜牡丹愈伤组织遗传转化的菌种。2选择性抗生素的确定试验对常用的选择性抗生素Kan和Hyg进行筛选,分别试验牡丹愈伤组织对其的敏感性。结果表明,牡丹愈伤组织对Kan极不敏感,Kan不适宜做为牡丹愈伤组织的筛选抗生素,而牡丹愈伤对Hyg极敏感,3mg·l-1的浓度即可使愈伤良好率大幅下降,因此选择Hyg做为适宜牡丹愈伤组织遗传转化的筛选抗生素,筛选浓度为3mg·l-1。3抑菌性抗生素的确定试验对常用的抑菌性抗生素Cef和Cb进行筛选,分别试验牡丹愈伤组织对其的敏感性,同时试验抑菌性抗生素Cef和Cb的抑菌效果。结果表明,牡丹愈伤组织对Cb敏感性较弱,相对来说对Cef较为敏感。抑菌效果试验表明Cef的抑菌效果优于Cb,因此选用Cef做为牡丹愈伤组织共培养后的抑菌抗生素,添加浓度以不超过200mg·1-1为宜。4牡丹愈伤组织遗传转化体系的初步构建本试验通过农杆菌介导的方法,最终选用农杆菌菌株LBA4404对牡丹愈伤组织遗传转化体系进行初步的研究。对遗传转化过程中影响转化率的各项影响因子(预培养时间、菌液浓度、侵染时间、共培养时间及温度等)的最适条件进行了初步筛选,并初步建立以细菌的植物组织培养基悬浮液侵染法的牡丹愈伤组织遗传转化体系:挑取LBA4404单菌落于YEB液体培养基中,置于摇床28℃环境中220rpm振荡培养过夜,将菌液室温4000rpm离心10min,弃上清,用植物液体培养基W0重悬菌体至OD600=0.6。将继代后的牡丹愈伤组织切至0.2X 0.2cm大小,不经过预培养,直接用OD600=0.6的菌液侵染20min,将侵染后的愈伤置于滤纸上晾干后,接入共培养培养基,在22℃黑暗环境下共培养3d。随后用200mg·l-1Cef水涮洗浸泡愈伤30min,尽量洗净残留菌体,后接入含有100mg·I-1Cef的液体增殖培养基,振荡培养24h,随后将愈伤取出,经无菌水涮洗后置于滤纸上晾干,接至含有1OOmg·l-1Cef和3mg·l-1Hyg的固体筛选培养基中,20d转接一次。5 GUS组织化学染色方法的优化本试验对GUS组织化学染色方法进行优化,参照Jefferson的方法,试验中发现牡丹愈伤组织在37℃环境下染色后,全部褐化死亡,无GUS瞬时表达活性。因此根据牡丹愈伤对温度较为敏感的特性,将染色温度优化至24℃,染色后均能成功检测到GUS瞬时表达活性。