笃斯越橘(Vaccinium uliginosum L.)果实多糖的提取纯化、结构鉴定及生物活性研究

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笃斯越橘(Vaccinium uliginosum L.),是杜鹃花科越橘属植物。其果实富含多糖、花青素苷及黄酮等多种成分。研究发现,笃斯越橘果实多糖具有抗氧化性、抗衰老、调节免疫功能等生物活性,在临床应用方面具有重要的价值,其资源的开发利用在经济发展方面也具有重要的意义。因此,本论文对笃斯越橘果实多糖的提取、纯化、结构及活性等方面进行了研究,为进一步开发笃斯越橘果实多糖资源提供了理论基础。采用加压溶剂法提取笃斯越橘果实多糖,首先进行单因素试验,考察液料比、提取温度、时间、压力四个因素对多糖得率的影响。在此试验基础上,利用中心组合设计实验,以多糖的得率作为考察指标,采用响应面分析法优化提取工艺。确定了笃斯越橘多糖提取的最优工艺为提取温度81℃、提取时间23min、压力1.2MPa。此条件下多糖得率达到7.57%。验证试验得到多糖的得率是7.48±0.11%。采用聚酰胺法对笃斯越橘果实多糖进行初步纯化,得到了笃斯越橘多糖VUP-Ⅰ,脱色率为62.54±1.27%,蛋白去除率达到89.87±0.85%,多糖回收率为50.47±0.97%,多糖VUP-Ⅰ纯度为55.65±0.39%。选择葡聚糖凝胶Sephadex G-100进一步分离纯化多糖VUP-Ⅰ,条件为:上样浓度17mg/m L,洗脱剂去离子水,上样量0.8m L,洗脱流速1m L/min。主要得到两个多糖组分VUP-Ⅱ-1和VUP-Ⅱ-2。纯度分别是83.35±0.32%和74.94±0.17%。测定笃斯越橘果实多糖VUP-Ⅱ-1的理化性质及结构。试验表明:多糖VUP-Ⅱ-1是灰白色粉末状固体,无味;易溶于水,不溶于乙醇、丙酮、正丁醇、氯仿等有机溶剂;不含有蛋白质、还原糖、淀粉和酚类等物质。硫酸-咔唑法测VUP-Ⅱ-1中糖醛酸含量为20.34±1.02%。通过高效液相色谱法测定多糖VUP-Ⅱ-1的重均分子量Mw为4.98×104 ku,数均分子量Mn为3.23×104 ku,分子量分布指数α为1.54。气相色谱分析确定了多糖VUP-Ⅱ-1的单糖组成,笃斯越橘多糖VUP-Ⅱ-1是由阿拉伯糖和半乳糖组成,其物质的量的比为5:2。红外光谱显示了多糖VUP-Ⅱ-1具有多糖的特征吸收峰,推测其可能含有吡喃糖苷键。紫外光谱显示了多糖VUP-Ⅱ-1在260nm、280nm处没有特征吸收峰,证明其不含蛋白质、核酸及多酚类等物质。电镜扫描观察多糖VUP-Ⅱ-1的体观形貌特征,多糖VUP-Ⅱ-1呈链状结构,还带有许多分支,糖链之间互相交错,呈现环状的聚集体,且有一定的柔顺性,分子之间的交互作用较强。通过刚果红试验分析多糖VUP-Ⅱ-1有三股螺旋构象。笃斯越橘多糖VUP-II-1抗氧化性研究表明,多糖VUP-II-1对DPPH·、OH·、O2-·有一定的清除作用,清除率与其浓度呈现正相关趋势,当浓度为1.2mg/m L时,清除率分别是93.86±0.59%、11.68±0.34%和5.50±0.83%。多糖VUP-Ⅱ-1还原能力与其浓度呈现正相关趋势,在0~1.2mg/m L范围里,表现出一定的还原能力,当浓度为1.2mg/m L是,其还原能力为1.14±0.05。笃斯越橘多糖VUP-Ⅱ-1对α-淀粉酶的清除试验表明,多糖VUP-Ⅱ-1对α-淀粉酶存在抑制作用,在一定的浓度范围内,抑制作用与浓度呈正相关趋势,当浓度为4mg/m L时,抑制作用可达到37.23±0.45%。多糖VUP-Ⅱ-1对蛋白质非酶糖基化反应初期Amadori的形成、中期二羰基化合物的生成以及末期AGEs终产物的形成均表现了良好的抑制作用。在此反应中,多糖VUP-Ⅱ-1对中期和末期AGEs中产物的抑制率分别达到了42.10±0.61%和45.93±1.27%,明显高于反应初期Amadori产物的抑制率29.91±0.84%。这就说明笃斯越橘果实多糖对蛋白质的非酶糖基化反应的抑制作用主要发生在反应中期及反应末期。
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