叶衰老是一个复杂的生物学事件,通常发生在叶发育的最后阶段,由很多发育和环境信号参与控制。防御反应在植物抵御病原菌入侵的过程中发挥着重要的作用。很多研究对叶衰老和防御反应进行了阐释,但是这两个生物学过程所涉及的分子机理我们并不完全知晓。本研究得到一个水稻类病变突变体spl29(spotted leaf29),其从苗期开始以及在之后的生命历程中表现出类病变(LM, lesion-mimic)斑点叶和快速的叶衰老。克隆spl29的突变基因有望发现一个在水稻中参与叶衰老和防御反应的新基因,为进一步阐释这两个生物学过程的分子机理打下基础。遗传分析显示,spl29的F2群体中,野生型和类病变斑点突变表型植株呈现3：1的分离比,这说明spl29的表型是受一个隐性的核基因控制的。采用图位克隆的方法克隆SPL29基因。经过初步定位和精细定位,最终将SPL29基因位点限定在水稻8号染色体上分子标记S8和S26之间约97kb的基因组区域内。通过NCBI Blast分析,以及RAP-DB (Rice Annotation Project Database)、RGAP (Rice Genome Annotation Project)网站上的注释查询,发现该基因组区域内存在10个可能的开放阅读框(ORF, open reading frame)。对这10个ORF的基因序列进行野生型和spl29之间的测序对比分析,在spl29的5号基因LOC_Os08g10600的第8个外显子上发现了一个G到T的点突变,该点突变造成编码的氨基酸由甘氨酸(Gly)替换成半胱氨酸(Cys)。为了初步确定该位点G到T的点突变导致spl29的突变表型,对10个不同的水稻栽培品种、F2非类病变(NLM,non-lesion-mimic)植株和F2类病变植株进行了测序分析,发现该位点在spl29和所有F2LM植株中为T,而在10个不同的正常水稻品种中均为G,在F2NLM植株中为G或者是G/T并存。因此,LOC_Os08g10600很有可能就是SPL29。利用野生型ZH11中包含LOC_Os08g10600启动子、基因区和终止子序列的一个7888bp的基因组片段,构建功能互补载体pSPL29C,通过农杆菌转化进入突变体spl29愈伤组织。同时,也将空载体pEmvC转化spl29愈伤组织作为对照。植株再生后,所有含有野生型SPL29基因的22个独立的转基因株系都完全互补了spl29的叶突变表型,而所有转空载体的16个独立转基因株系还是呈现spl29的叶突变表型。因此,利用野生型的候选基因成功的互补了spl29植株的叶突变表型,LOC_Os08g10600就是要克隆的目标基因SPL29。利用SPL29的预测氨基酸序列进行Pfam分析,结果显示SPL29属于UDPGP (UDP-glucose pyrophosphorylase)基因家族(PF01704)。NCBI BLASTP结果显示,SPL29在水稻中可能是一个UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶1(UAP1)基因,而不是UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(UGP)基因。系统发育树分析表明,所有真核生物中的UAPs,包括SPL29,处于一个有别于UGPs的独立的进化分支。另外,NCBI BLASTP显示,SPL29与所有真核生物UAPs的氨基酸同源性都高于30%。这些结果都表明SPL29可能编码一个水稻UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶1基因。为了揭示SPL29和突变型sp129蛋白是否执行UAP酶学活性,经过蛋白表达和纯化后得到了分子量正确的GST(glutathione S-transferase)-SPL29和GST-sp129融合蛋白。采用1H-核磁共振(1H-NMR,1H-nuclear magnetic resonance)光谱的方法来原位监测SPL29和sp129的酶学反应。结果显示,GST-SPL29可以催化N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸(GlcNAc-1-P, N-acetylglucosamine-1-phosphate)和UDP-N-乙酰氨基葡萄糖(UDP-GlcNAc, UDP-N-acetylglucosamine)之间的可逆转换；GST-SPL29也可催化UDP-N-乙酰氨基半乳糖(UDP-GalNAc, UDP-N-acetylgalactosamine)成为N-乙酰氨基半乳糖-1-磷酸(GlcNAc-1-P, N-acetylglucosamine-1-phosphate)。有趣的是,GST-sp129不能催化这些酶学反应。NMR实验给出了明确的证据证明SPL29具有UAP酶学活性,而SPL29突变成sp129后丧失了这些UAP酶学活性。叶绿素含量的下降和植物光系统Ⅱ(PSⅡ,photosystem Ⅱ)功能的下降是指示叶衰老的重要生理指标。测定结果显示,spl29叶片中的叶绿素含量相比于野生型下降了。衰老诱导的STAY GREEN (SGR)基因在调节叶绿素降解的过程中发挥着重要的作用；荧光定量PCR (qRT-PCR,quantitative real-time PCR)分析表明,SGR在spl29叶片中明显地上调表达。另外,通过叶绿素a荧光诱导动力学曲线分析,发现spl29的整个PSⅡ机构都被损坏而导致功能受抑制了。叶绿素含量的降低以及PSⅡ功能的下降表明spl29植株在生理水平上已经步入了叶早衰过程。突变体spl29叶肉细胞的超微结构显示,发育完好且膜完整的叶绿体在许多spl29叶肉细胞中可以看到,然而在一些细胞中叶绿体膜正在破裂,同时在spl29中大量存在已经丧失了叶绿体却还保留着线粒体的叶肉细胞。这些结果表明在spl29中,叶绿体最初发育良好,但在叶早衰的过程中被完全降解了。叶绿体的破裂可能是spl29中叶绿体降解的一种机制。突变体spl29叶中猛烈、不可逆转且完全的叶绿体降解方式在细胞水平上支持了其快速的叶早衰表型。通过qRT-PCR分析,衰老相关的转录因子,OsWRKY23、OsWRKY72和OsNAC2在spl29叶片中表达上调。衰老相关基因(SAGs, senescence-associated genes)Osl2、Osl30、Osl43和Osl85的表达水平也在spl29叶片中上调了。同时,细胞核控制的光合合成相关基因rbcS、lhcA和lhcB,以及叶绿体控制的光合合成相关基因rbcL、psaA、psbA、petD、ndhA和atpA,在spl29叶片中均表达下调。突变体spl29中支持叶早衰的这些分子证据表明,该突变体的叶早衰不是一个消极的非调控的退化过程,而是一个积极的完好的遗传调控过程。当接种白叶枯病菌PX099后,野生型植株表现出典型的白叶枯病反应,而spl29植株却呈现大大增强了的抗病性。采用qRT-PCR的方法,发现防御信号相关基因,PR1a、PBZ1、PO-C1和OsWRKY45,它们的表达水平均在spl29叶片中上调。这些结果表明,在spl29突变体中,防御反应被诱导了,进而加强了植株抗病能力。通过组织化学染色,活性氧分子(ROS, reactive oxygen species)——超氧阴离子(02-)和过氧化氢(H202)在spl29植株叶片中积累。进一步测定了脂质过氧化终端产物丙二醛(MDA, malondialdehyde)的含量,发现其也在spl29叶片中积累。为了探索spl29植株中的ROS代谢过程,检测了植物抗氧化酶超氧化物歧化酶(SOD, superoxide dismutase)和过氧化氢酶(CAT, catalase)的酶学活性,SOD活性在spl29叶片中增强,而CAT活性在spl29和野生型叶片中没有明显差异。这些结果表明,SOD活性的增强可能是spl29突变体积极地响应其内部O2-的积累,从而产生更多的H202；而正常的CAT活性可能不足以清除这些过多的H2O2,进而导致H202在spl29中积累。积累的ROS可能在spl29的叶早衰和防御反应过程中发挥着重要的作用。研究还发现,两种植物激素,茉莉酸(JA, jasmonic acid)和脱落酸(ABA, abscisic acid)的含量在spl29植株叶片中大量上升,推测在spl29中积累的JA和ABA可能参与了其本身的叶早衰和防御反应途径。综上所述,水稻UAP1的功能失活导致了spl29中叶早衰和防御反应的产生ROS (O2和H202)和植物激素(JA和ABA)都有可能参与了spl29的这两个生物学途径。OsUAP1可能在调节水稻叶衰老和防御反应的过程中发挥着重要的作用,其确切的分子机理有待深入研究。