橡胶草遗传转化体系的建立及HMGR1的转化研究

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巴西橡胶树(Heveabrasiliensis)是一种重要的热带经济林木,其胶乳是目前工业用天然橡胶的主要来源。目前,多数以花药为外植体获得植株,与一些模式材料相比整个周期相较长。因此,通过转基因技术对一些产胶相关重要调控基因在橡胶树进行表达功能鉴定周期长、难度大。橡胶草也是一种产橡胶植物,所产橡胶与巴西橡胶树橡胶结构和功能相似,本研究旨在建立其再生体系和遗传转化体系,为橡胶草转基因提供参考,通过转基因对一些产胶相关重要调控基因在橡胶树进行表达功能鉴定奠定基础。 本研究以橡胶草为试验材料,以叶片叶柄、根为外植体,研究了不同激素浓度配比对橡胶草愈伤组织、不定芽和根诱导的影响。初步建立了橡胶草的再生体系。实验结果表明,以根为外植体的再生能力比叶片叶柄强;已筛选出诱导愈伤组织、不定芽和根的最佳培养基。研究中发现,叶片叶柄接种到6-BA(1mg.L-1)+NAA(0.3mg.L-1)的培养基上,经过一段时间的培养,可直接再生出不定芽。再生芽在1/2MS+NAA(0.5mg.L-1)培养基上15天左右可以诱导出根,生根率可达100%,完全可以满足转化的需要。 在建立了橡胶草再生体系的基础上,利用农杆菌介导叶盘转化法进行遗传转化的研究。实验结果表明,叶盘预培养、浸染时间、共培养时间、乙酰丁香酮浓度均对橡胶草的遗传转化效率有较大影响。最佳转化条件为叶盘不经过预培养,浸染10min,共培养2天,脯氨酸2mg.L-1,乙酰丁香酮浓度为30μmol.L-1。共培养后把外植体分别转接愈伤诱导培养基(MS+6-BA0.5mg.L-1+2,4-D0.1mg.L-1+Hyg20μg.L-1)和分化芽培养基上(MS+6-BA0.8mg.L-1+NAA0.3mg.L-1+Hyg20μg.L-1),20天后分别有愈伤或者芽分化,愈伤继代2次后分化芽需30天,因此,直接诱导芽分化比间接分化芽节省时间。 构建了巴西橡胶树HMGR1融合表达载体pCAMBIA1302-HMGR1在野生蒲公英中瞬时表达,得到了较高的瞬时表达率。在初步建立了橡胶草的遗传转化体系后,将融合表达载体转入橡胶草,获得了6株转基因植株,并且PCR检测为阳性。
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