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随着科技的迅速发展,工农业生产中出现了越来越多的环境污染问题,其中,镉污染尤其对生殖系统,呈现了环境内分泌干扰物的毒性作用。本研究首先探索了氯化镉对雌性鸡胚卵巢生殖细胞减数分裂的抑制作用;其次,鉴于原花青素具有广泛的药理活性,能够清除自由基,保护免疫系统,抗过敏、抗肿瘤,调节功能性酶等。选取了葡萄籽提取物原花青素,进一步探索其对镉导致的减数分裂抑制的缓解作用,为探明镉的作用机制及防治提供依据。 1.镉对鸡卵巢发育的影响 镉作为一种无机内分泌干扰物,有毒重金属的典型代表,已广泛存在于人类日常生活环境中,造成严重的潜在危害。本研究以海兰鸡胚为实验材料,随机分为四组,每组50个胚。氯化镉(CdCl2)采用四个剂量组,分别是0、1.5、3.0和6.0μg/枚,在性腺分化后即胚胎期E6.5进行气室注射,在减数分裂期E17.5、出壳或出壳后两周取出卵巢,4%多聚甲醛固定,做石蜡切片,HE染色观察鸡胚卵巢组织形态学的变化,试验结果表明在鸡胚孵化至E17.5,卵巢组织出现了比较明显的发育抑制,进入减数分裂的生殖细胞数目明显减少。因此,取E17.5作为后续试验的取材时间。通过卵巢重、体重、孵化率的统计以及HE染色、细胞凋亡检测,免疫荧光(减数分裂γH2AX标志蛋白的定位定量)和荧光定量PCR(基因表达量的检测)等方法研究镉对生殖细胞减数分裂的影响。试验结果表明,3.0μg/枚的镉可引起鸡胚卵巢明显的发育抑制,进入减数分裂的生殖细胞数目显著减少,其表现为卵巢重、体重均有一定的下降,孵化率也明显降低,减数分裂标志蛋白γH2AX的表达量明显减少,减数分裂标志基因(Stra8,Spo11,Scp3 and Dmc1)也呈现了不同程度的显著下降。同时,维甲酸信号通路也有一定程度的抑制,维甲酸合成酶Raldh2和受体(RARα、RARβ)表达量显著下降。进一步的研究发现,3.0μg/枚的镉对出壳后两周卵泡发育也有一定的抑制作用。镉剂量组与对照组相比,生殖细胞簇内卵母细胞的数量增多,原始卵泡的数目明显的减少,初级卵泡的数量也有一定程度的降低。以上结果表明,一定剂量的镉可抑制卵巢生殖细胞的发育,并且可能通过抑制减数分裂的进程,导致卵泡数量的减少。 2.原花青素对镉引起的鸡卵巢减数分裂抑制的缓解作用 目前,有关镉对于雌性性腺毒性和具体的防御措施仍不清楚。前期的研究结果表明镉能够抑制鸡胚卵巢生殖细胞的减数分裂,然而,减数分裂是生殖发育的重要过程之一,因此研究原花青素对镉引起的减数分裂抑制的缓解作用及其机理对于保护雌性动物的卵子发生具有重要的意义。HE染色、糖原染色、吉姆萨染色和免疫荧光结果表明,与对照组相比,镉(3.0μg/枚)暴露于E6.5至E17.5,明显降低了进入减数分裂的生殖细胞数目,减数分裂标志蛋白γH2AX的表达量显著下降。相应的,减数分裂标志基因(Stra8,Scp3,Spo11和Dmc1)的表达也呈现了差异显著性降低。同时,起始减数分裂的经典途径维甲酸信号通路也有一定的变化,维甲酸合成酶Raldh2和受体(RA Rα和RARβ)也呈现差异显著降低,伴随着维甲酸降解酶Cyp26b1轻微的升高。另外,镉暴露增加了卵巢中过氧化氢(H2O2)和丙二醛(MDA)有害物质的含量,谷胱甘肽(GSH)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性明显降低。然而,添加原花青素后,进入减数分裂的生殖细胞明显增多,卵巢皮质的厚度也有一定程度增加,维甲酸信号通路趋于正常,明显缓解了镉导致的氧化应激。