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本论文利用Sanger测序方法,研究中国地方猪miR-378的前体miR-378-2序列突变,分析突变的遗传效应,探索突变对miR-378表达量及功能的影响,研究结果如下:1.荣昌猪和内江猪miR-378的前体miR-378-2序列均存在+49A>G突变(miR-378种子序列的+5A>G)和+68A>G两个突变。这两个突变都会影响miR-378的表达量,+49A>G突变还会引起miR-378功能的改变。2.含有两个突变位点的miR-378-2序列二级结构和自由能预测结果显示,突变后的miR-378-2二级结构和自由能均发生了显著变化,茎结构凸环变小,自由能熵值下降17.2%。说明miR-378-2序列突变使其二级结构越稳定,更有利于酶的识别和加工。3.通过构建 miR-378-2 野生型(miR-378-2W)和 miR-378-2 突变型(miR-378-2M)表达载体,并在HEK293细胞中进行体外过表达,分析序列突变对miR-378加工与表达的影响。结果发现,miR-378-2M组的成熟体表达量约为miR-378-2W组的2倍(P<0.01),miR-378-2M 组的 pri&pre-miR-378-2 表达量约为 miR-378-2W 组的 1.6倍(P<0.01),miR-378-2W组与miR-378-2M组的pri-miR-378-2表达量差异不显著(P>0.05),说明miR-378-2的序列突变导致了 pre-miR-378-2和miR-378的表达量上调。4.野生型miR-378和突变型miR-378的靶基因预测结果显示,miR-378种子序列+5A>G突变导致大量靶基因改变,靶基因的总数增加了 27个,获得了 58个靶基因,缺失了 31个靶基因,有13个靶基因不受该突变的影响;对预测的靶基因进行GO和Pathway分析,结果表明,miR-378种子序列+5A>G突变导致miR-378的调控通路也发生了改变。说明miR-378种子序列+5A>G突变不仅影响靶基因的识别,还影响miR-378的生物学功能。5.通过随机抽样挑选出GDF6,Runxlt1,Galnt3和RAB10四个靶基因,利用双荧光素酶报告和RNA-pull down实验技术进行靶标验证,结果发现GDF6为miR-378突变获得的靶基因,RAB10为miR-378突变缺失的靶基因,而Runxlt1扣和Galnt3为不受miR-378突变影响的靶基因;利用RNAhybrid软件预测靶基因与其miRNA结合的二级结构和最小自由能,证明miR-378种子序列+5A>G突变改变了 miR-378与靶基因结合后的二级结构和最小自由能,导致miR-378失去或获得部分靶基因。6.通过将miR-378W mimic,miR-378M mimic转化到3T3-L1前脂肪细胞进行诱导分化发现,miR-378M组的脂滴含量极显著低于miR-378W组,脂肪细胞分化基因PPAR-γ,PGC-1α和PGC-1β表达水平下调,脂肪分解代谢基因HSL,ATGL和CGI-58表达水平上调。说明miR-378种子序列+5A>G突变影响了脂肪细胞分化和脂肪分解代谢相关基因表达,导致脂肪细胞分化和脂质沉积的能力减弱。上述结果为研究miR-378种子序列突变后功能的获得或缺失奠定了基础,同时也为miRNA靶基因识别、鉴定和miRNA突变的功能验证提供了新思路。