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背景自抗体技术产生以来,通常以蛋白质作为抗原免疫小鼠。这些用于免疫的蛋白质通常从组织细胞中分离提纯或通过基因工程表达,其制备过程操作繁杂,且实验周期长;有些蛋白质的构象表位易发生改变,有些蛋白质甚至无法获得。用合成肽来取代蛋白质,价格昂贵、产量小。此外SARS以及禽流感、手足口等突发传染病不断地警示我们:突发传染性疾病随时可能给人类带来的灾难。这些突发传染病原常常亚型众多,加上基因突变、重组和重排,使其变异极快,早期血清学诊断无疑对预防、控制其传播具有重要意义。血清学诊断的前提是获得特异性抗体。制备抗体的传统方法速度慢并且费力。利用基因免疫方法(genetic immunization)制备单抗的原理是将编码目的蛋白的基因(代替常规的蛋白质抗原)经各种基因转移途径转入机体细胞,表达目的蛋白。目的蛋白在体内作为抗原,激发免疫应答,然后进行常规的细胞融合。基因免疫制备单抗可以制备针对天然表位的抗体,而且节省制备单抗时间2-3个月,是一种很有前途的抗体制备方法。目前常用的基因免疫方法,转基因的表达水平由于这种局部注射而相当低并且仅局限在注射部位。通过传统方法静脉注射质粒DNA,虽然可以使DNA分布在很多器官,但是质粒DNA进入体内后,迅速被血液及组织表面的核酸酶降解并且很快从血液循环中清除。为了克服这些问题,1999年Liu及Zhang等经小鼠尾静脉快速注射(3-8 s内完成)大体积质粒DNA溶液(占小鼠体重的8%-12%),发现在短时间内小鼠多种组织中即有目的基因的表达,其中在肝脏组织中表达水平最高,这种方法被称为水流动力学注射(hydrodynamics-based procudure)。应用此方法大大提高了质粒DNA的转染效率,从而升高了蛋白的表达。水流动力学出现以来,在基因治疗方面被得到广泛的应用,但是在基因免疫制备抗体方面却未有报道。死亡受体5(death receptor,DR5)是肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand,TRAIL)的主要受体之一,TRAIL可引起许多肿瘤细胞系的凋亡,对绝大多数正常细胞不具有凋亡效应,被认为是癌症治疗的潜在的生物制剂。DR5与TRAIL结合后可以通过其胞内的死亡结构域传递凋亡信号,从而引起细胞凋亡的发生,是激活凋亡途径的很好的靶标。目的通过水流动力学方法提高基因转移的效率,从而制备高效价的血清,并提高基因免疫制备单抗的效率,为制备抗体提供一条新的路径。方法将DR5基因克隆pcDNA3.0载体中,测序鉴定正确。分别通过水流动力学注射法和常规肌肉注射方法免疫小鼠,通过免疫组化和Western blot鉴定表达产物,ELISA测定抗体的效价。通过杂交瘤技术筛选抗DR5单克隆抗体。通过非竞争ELISA方法分析了单抗的亲和常数,通过ELISA方法分析了单抗的亚型,流式细胞术检测单抗与Jurkat细胞表面的DR5结合。结果构建了真核表达重组质粒pcDNA3.0/DR5。通过水流动力学方法和肌肉注射两种方法免疫小鼠,间接ELISA结果显示末次免疫后水流动力学免疫组抗体滴度最高可达到为1:102 400,肌肉注射免疫组抗体滴度最高为1:25 600:Western blot结果显示小鼠抗DR5多克隆抗体识别识别Jurkat细胞的DR5蛋白条带。免疫组化结果表明转染的DR5蛋白主要表达在食管癌细胞核膜周围,与预期相符。通过细胞融合技术成功制备了一株抗DR5单克隆抗体A9。经分析其亚型为IgM,非竞争ELISA结果显示A9的亲合常数为1.64×10~9L/mol。流式细胞仪检测显示A9可以与Jurkat细胞表面的DR5特异性结合。结论本课题以DR5为例,建立了利用水流动力学进行基因免疫,制备抗体的新方法。该方法与常规的蛋白免疫方法相比,具有节省制备单抗时间,可以制备针对天然表位的抗体的优点;与肌肉免疫进行基因免疫方法相比,可以产生更高效价的血清,在western-blot试验中获得更好的效果,更加容易制备单克隆抗体。