2型猪链球菌(Streptococcus suis serotype2,SS2)作为一种重要的人畜共患病原菌,不仅可引起世界范围内养猪业的经济损失,还威胁着公共卫生安全。它在人间呈散发感染,所引起的病理表现通常只限于脑、心、肺及关节,且预后良好。然而,我国1998年江苏、2005年四川暴发的两起大规模SS2感染人的疫情却与既往报道的感染特点有显著不同:第一,首次出现大规模人群感染病例;第二,有很高比例的感染者呈现出典型的链球菌中毒性休克综合征(Streptococcal toxic shock syndrome,STSS)的临床症状,即使对这些患者使用大剂量抗生素干预,也无法扭转病程,许多患者都因为感染SS2后引起机体内细胞因子的瀑布式爆发而死亡。以上情况强烈提示,我国疫区出现了高致病性SS2变异株。　　为了对我国SS2流行菌株的高致病性进行深入研究,课题组前期利用基因芯片结合比较基因组学技术,将不同毒力、不同来源的18株SS2菌株基因组进行系统分析,从全基因组水平研究SS2在毒力和环境适应力方面的进化,发现我国SS2流行菌株所特有的89K毒力岛(89K PAI),在其他一些SS2菌株基因组中部分存在且呈现出丰富的多态性,还鉴定出了一些毒力因子为强毒株所特有。因此,在我国疫情株中特有的89K毒力岛和未被研究的毒力相关因子候选基因对2型猪链球菌致病性的贡献引起了我们的浓厚兴趣。本文从以下2个方面对2型猪链球菌进行研究:　　1.毒素-抗毒素(TA)系统SezAT在稳定89K致病岛中的作用。课题组前期的研究工作发现了我国高致病性SS2基因组特有的89K毒力岛,该毒力岛可以从宿主菌染色体上自发地切离并形成环形质粒样分子。为深入研究89K毒力岛的功能,课题组试图通过消除质粒的方法消除89K,始终未果。进一步分析发现89K上存在一个毒素-抗毒素(TA)系统SezAT,而TA系统是近年证实的一类能稳定质粒和基因组岛等遗传元件的功能系统。为揭示SezAT对89K毒力岛的稳定作用,本研究首先通过同源重组破坏SezAT系统,然后通过Cre/loxP位点特异性重组系统介导89K毒力岛的消除,筛选89K缺失株,并采用相同的重组工具尝试对没有破坏SezAT系统的89K毒力岛进行消除实验,以此作为对照,从而证实SezAT毒素-抗毒素系统的确为89K毒力岛上极其重要的稳定元件。利用基本生物学实验评价89K消除对SS2表型的影响。　　2.转录调控因子PlcR在致病性中的作用。课题组前期的研究工作鉴定出了一些毒力因子为强毒株所特有,在所鉴定的毒力因子中,转录调控因子PlcR由于在调节芽胞杆菌属细菌的毒力方面起十分重要的作用,且目前它在链球菌属中的功能研究尚未见文献报导,这使得我们对它产生了兴趣。为了探究PlcR在SS2致病过程中的作用,本研究利用生物信息学分析手段对其功能进行预测,此后再通过同源重组的方法敲除plcR基因,研究PlcR在SS2致病过程中的作用。　　本文的实验内容与结果主要包括以下几个方面:　　1.SezAT系统基因敲除株的构建:依据同源重组原理设计sezT基因敲除载体,该载体上的筛选用标记壮观霉素抗性基因盒Spcr两侧添加了Cre重组酶识别位点loxP,将该敲除载体电转05ZYH33电转感受态细胞,通过筛选具壮观霉素抗性表型的菌株,结合多重交叉PCR以及测序鉴定的方法,获得sezT基因缺失突变株。再以此菌株制备电转感受态,转入表达Cre重组酶的质粒pCrePA2,30℃培养条件删除抗性基因Spcr后,37℃培养条件消除质粒pCrePA2。通过多重PCR和测序的方法筛选鉴定得到不含抗性筛选标记的sezTloxP+/Spc-菌株,证实Cre/loxP位点特异性重组系统在SS2中可以工作。　　2.破坏SezAT系统的89K毒力岛的消除实验:依据同源重组原理,设计attL右侧loxP位点敲入质粒和attR左侧loxP位点敲入质粒。首先将attL右侧loxP位点敲入质粒电转sezTloxP+/Spc-电转感受态细胞,通过筛选具氯霉素抗性表型的菌株,结合多重交叉PCR以及测序鉴定的方法,获得attL右侧引入loxP位点的sezTloxP+/Spc-。再以此菌株制备电转感受态细胞,转入表达Cre重组酶的质粒pCrePA2,30℃培养条件消除89K毒力岛左半部后,37℃培养条件消除质粒pCrePA2。通过平行接种培养、多重PCR和测序的方法筛选鉴定得到89K毒力岛左半部缺失突变株。之后再将attR左侧loxP位点敲入质粒电转89K毒力岛左半部缺失突变株电转感受态细胞,通过筛选具壮观霉素抗性表型的菌株,结合多重交叉PCR以及测序鉴定的方法,获得attR左侧引入loxP位点的89K毒力岛左半部缺失突变株,再以此菌株制备电转感受态细胞,转入表达Cre重组酶的质粒pCrePA2,30℃培养条件消除89K毒力岛右半部后,37℃培养条件消除质粒pCrePA2。通过平行接种培养、多重PCR和测序的方法筛选鉴定得到89K毒力岛缺失突变株89K。　　3.未破坏SezAT系统的89K毒力岛的消除尝试:将attL右侧loxP位点敲入质粒电转05ZYH33电转感受态细胞,通过筛选具氯霉素抗性表型的菌株,结合多重交叉PCR以及测序鉴定的方法,获得attL右侧引入loxP位点的05ZYH33菌株。再以此菌株制备电转感受态细胞,转入attR左侧loxP位点敲入质粒,通过筛选具壮观霉素抗性表型的菌株,结合多重交叉PCR以及测序鉴定的方法,获得attL右侧引入loxP位点且attR左侧引入loxP位点的05ZYH33菌株,再以此菌株制备电转感受态细胞,转入表达Cre重组酶的质粒pCrePA2,30℃培养条件消除89K毒力岛右半部后,37℃培养条件消除质粒pCrePA2。通过平行接种培养、PCR的方法筛选89K毒力岛缺失突变株89K,没有获得89K缺失突变株。此项对照实验凸显了SezAT系统对89K毒力岛具有极其重要的稳定作用。　　4.89K菌株的基本生物学性状分析:相同培养条件下比较野生株05ZYH33与突变株?89K在生长曲线、溶血活性以及荚膜形态上的差异。结果显示,缺失89K毒力岛对SS2的这3个基本生物学性状没有显著影响。　　5.PlcR的生物信息学分析:运用NCBI数据库的BLAST比对工具对05SSU0241和05SSU0242基因的编码产物进行比对分析,发现二者与蜡样芽胞杆菌的PlcR蛋白的相似性分别为46％与28%,再利用Pfam软件和InterPro软件对这2个基因的编码产物进行结构域预测,分析结果显示05SSU0241基因编码产物含有一个λ抑制子样的HTH结构域((Lambda repressor-like helix-turn-helix domain),这一结构域为特异的DNA结合区域,许多具有此结构域的蛋白都发挥转录调节子的作用。05SSU0242基因编码产物含有一个肽重复序列结构域(Tetratricopeptide repeat,TPR),这种结构域可介导蛋白质相互作用,并在一些重要的蛋白复合物的形成中扮演重要角色。这些生物信息学分析结果都提示,05SSU0241与05SSU0242可能就是链球菌属中的plcR基因,对相关基因行使转录调节功能,但尚需实验验证。　　6.plcR基因缺失突变株的构建:依据同源重组原理设计plcR基因敲除载体,以05ZYH33基因组DNA为模板,分别扩增plcR基因上下游片段作为plcR基因敲除载体的同源左右臂,再以pSET4S质粒DNA为模板,扩增得到抗性基因盒Spcr,将所得片段纯化后依次连接到pUC18载体中,成功构建plcR基因敲除载体。将该载体电转05ZYH33电转感受态细胞,筛选壮观霉素抗性表型的菌株,结合多重交叉PCR和测序的方法鉴定获得plcR基因缺失突变株plcR。　　7.plcR基因与SS2毒力关系的初探:采用相同菌量(107CFU/ml)的野生株05ZYH33和突变株plcR攻击BALB/c雌性4周龄小鼠,将两组小鼠分别命名为野生组与敲除组,结果显示,这2组小鼠均出现典型的SS2感染症状,但是敲除组在感染12h后不再有小鼠死亡,且存活小鼠预后良好,死亡率为30%,而野生组小鼠感染症状较敲除组严重,死亡率为60%,小鼠攻毒实验显示,plcR基因缺失突变株的毒力较野生株显著降低,这提示我们plcR基因与SS2的致病性相关。　　综上所述,本文通过比较SezAT毒素-抗毒素系统破坏前后,利用Cre/loxP位点特异性重组系统消除89K毒力岛的效率,证实SezAT系统作为极其重要的稳定元件在89K毒力岛稳定存在于基因组中发挥关键作用。再通过89K毒力岛缺失前后的基本生物学性状的差异比较,发现89K毒力岛对实验中考察的3个基本生物学性状没有显著影响,获得了一株89K毒力岛缺失突变株,为后续研究89K PAI对SS2致病性的贡献奠定了实验基础。另一部分对于PlcR转录调控因子的生物信息学分析结果提示SS2中的plcR基因可能存在转录调节功能,通过实验构建plcR基因缺失突变株,比较野生株05ZYH33与突变株plcR对小鼠的致死率,结果显示,plcR基因确实与SS2的致病性存在相关性。