研究背景及目的 在多器官功能衰竭(multiple organ failure，MOF)和全身性炎症反应综合症(systemic infammatory response syndrome，SIRS)中，引起血管EC单层通透性增高的炎症介质大多数是通过血管内皮细胞(endothelial cell，EC)骨架发生变化，使EC收缩和回缩，EC间隙增大，EC单层通透性增高，因此，了解EC通透性增高的机制至关重要。研究显示，Rho GTPase家族成员特别是RhoA在EC通透性增高中起重要作用，Rho GTP酶通过影响F-actin的聚合来调节EC的屏障功能。本课题旨在探讨脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)和凝血酶对血管EC单层通透性的影响、EC肌动蛋白细胞骨架改变及其与RhoA mRNA表达之间的关系；同时用Y-27632(Rho激酶抑制剂)验证LPS和凝血酶对血管EC单层通透性的影响及与细胞肌动蛋白骨架改变之间的关系。试图阐明Rho GTP酶是否为调节EC肌动蛋白细胞骨架形成的重要信号分子，在炎症介质介导的EC单层通透性增高的过程中是否起主要的信号转导作用，并探讨治疗细胞屏障功能损伤的靶位点。 方法 (1)采用Transwell chamber弥散模型，分别检测不同浓度的凝血酶、LPS对ECV304细胞单层通透性影响；EC经10μM Y-27632处理后，观察凝血酶、LPS对血管EC单层通透性影响。(2)利用异硫氰酸盐标记的鬼笔碱对EC的肌动蛋白细胞骨架进行染色，用荧光倒置显微镜观察凝血酶和LPS对EC肌动蛋白细胞骨架分布变化及Y-27632阻断凝血酶和LPS诱导的EC肌动蛋白细胞骨架重排的影响。(3)采用RT-PCR法测定EC中RhoA mRNA的表达，用Bio-Rad凝胶成像分析仪作半定量分析。 结果 (1)LPS、凝血酶可明显增加EC单层的通透性(p＜0.05)，呈一定的剂量-时间依赖性。凝血酶在5分钟内使EC单层通透性明显升高，EC单层通透性在2小时内逐渐回落到基线水平；LPS使EC单层的通透性在120分钟内持续升高。Y-27632可抑制凝血酶和LPS诱导EC单层通透性的增加(p＜0.05)。(2)荧光倒置显微镜下，EC的F-actin呈网状排列，细胞周边偶有应激纤维形成。LPS和凝血酶作用lh后，EC肌动蛋白骨架解聚，排列紊乱，F一actin穿越细胞中央，细胞周边形成应激纤维，丝状伪足及层状伪足，EC明显回缩，细胞间隙明显增加。与对照组相比，用Y一27632处理的EC组的肌动蛋白细胞骨架排列略紊乱，细胞周边应激纤维消失，无明显的丝状伪足和片状伪足形成。(3) RT一PCR检测分析显示:EC有Rh0A基因的表达，当LPS和t知旧mbin作用EC后，随着炎症介质作用浓度的增加，其表达水平明显上调。 结论在LPS和凝血酶引起EC肌动蛋白细胞骨架解聚及EC单层通透性增高过程中，.助。A的表达明显增强，RhoA激酶信号转导途径被激活、Y一27632可抑制LPS、凝血酶诱导的EC肌动蛋白细胞骨架解聚及EC单层通透性增高。提示孙。GTPases在炎症介质介导的EC单层通透性增高的过程中起主要的信号转导作用，阐明Rho GTP酶在这一病理过程中的作用，将为全身性炎症反应综合症防治提供新的策略。