目的：癌症的基因治疗是一种有可能根治肿瘤和转移而不损伤正常组织的特殊治疗手段。在自杀基因治疗中,基因编码的激酶首先被转导入肿瘤表达,再辅以前药治疗是最常见的肿瘤自杀基因治疗策略,核苷酸激酶可以磷酸化核苷酸类似物(癌前药物)为毒性代谢产物,干扰DNA的合成复制,从而导致肿瘤细胞死亡。目前广泛应用的基因治疗系统为单纯疱疹病毒1型胸腺嘧啶激酶/戊环鸟苷(HSV-TK/GCV)系统。GCV本身无毒性,在HSV-TK作用下,变成GCV单磷酸盐(GCV-MP),再经内源性细胞激酶作用,迅速转化为其二磷酸(GCV-DP)和三磷酸盐(GCV-TP),后者对增殖中的哺乳动物细胞具有高度毒性。虽然哺乳动物细胞胸腺嘧啶激酶也能催化GCV的转化,但HSV-TK的作用比其强200倍。事实说明HSV-TK/GCV引起肿瘤细胞凋亡。HSV-TK/GCV系统不仅能杀灭表达HSV-TK的细胞,且GCV-TP能够通过细胞间缝隙连接杀死毗邻的未转染HSV-TK的癌细胞,即具有显著的旁观者效应(bystander effect,BSE)。其它被普遍研究的还有细菌胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶(CD/5-FC)系统,自杀基因的治疗效率已被许多肿瘤的细胞实验和动物模型所证实,包括肝癌,大肠癌,黑色素瘤,白血病,胰腺癌,卵巢癌及视网膜母细胞瘤。虽然在基础实验的治疗效果被肯定,但自杀基因在临床上的应用有着杀伤效率有限及使用安全性问题。　　 胃癌是目前中国和世界上最高发的恶性肿瘤之一,每年有934,000胃癌患者被诊断,650,000患者因胃癌死亡,目前,除了胃癌根治术没有任何有效的治疗手段,尽管经过严格的外科护理,胃癌依然存在高复发率,晚期胃癌更是缺少治疗方法,通过最近在胃癌细胞克隆HSV-FK基因的研究表明,自杀基因可能对胃癌产生很好的杀伤效果。　　 果蝇多底物脱氧核苷酸激酶基因(multisubstrate deoxyribonucleoside kinase ofDrosophila melanogaster,Dm-dNK),Munch-Petersen和他的合作者[11]从果蝇身上提纯了这种激酶,并发现它能够催化自然界所有嘌呤嘧啶脱氧核糖核酸的磷酸化反应,除了其广泛的底物特异性,这种激酶还表现出惊人的催化效率,要高出我们所曾了解的核酸激酶效率的10-100倍,正是由于它的这种特殊性使其成为激酶家族的独特成员,Zheng X等克隆了Dm-dNK的cDNA并发现它亦能对某些抗病毒或抗肿瘤药物,如核苷酸类似物,起到有效的磷酸化作用。在最近的实验中,研究者试着使Dm-dNK在癌细胞种系中表达来起到一种自杀基因的作用,试验成功证明这种酶在癌细胞表达的可能性以及其在癌细胞中酶活性的保持,不仅如此Dm-dNK还增加了癌细胞对某些化疗药物的敏感性。　　 本实验利用不同类型病毒载体将Dm-dNK基因导入胃癌细胞系MGC-803,BGC-823,加入不同浓度的不同种类核苷类药物,分析Dm-dNK对癌细胞的杀伤作用及不同癌细胞系对Dm-dNK的敏感性后,进而做荷瘤动物实验,探讨Dm-dNK/核苷类似物对胃癌细胞体内外的影响,建立一种新的自杀基因治疗方式,为有效干预胃癌发生、发展提供有力的实验基础。　　 方法：　　 一、逆转录病毒及腺病毒载体的构建及转染根据Dm-dNK的cDNA,在其两端设计出带EcoRI和XhoI的酶切位点的引物,利用聚合酶链式反应(PCR)将Dm-dNK克隆到逆转录病毒载体pLXSN中,成为pLXSN-dNK。另外,将Dm-dNK的终止密码敲出,与绿色荧光蛋白基因(GFP)融合成为dNK-GFP,该表达框插入到pLEGFPN1载体中成为pLEGFPdNK,使Dm-dNK的表达及转染率能够通过荧光来观察。　　 逆转录病毒包装细胞PT67,人胃癌细胞系MGC-803和BGC-823在37℃含有10％胎牛血清的DMEM培养基中培养。构建好的质粒pLXSN-dNK和pLEGFP-dNK使用LipofectAMINE转染至PT67细胞并用G418筛选出稳定克隆,收集上清中的病毒感染胃癌细胞系48小时,加相应浓度G418筛选出单克隆,根据感染的病毒pLXSN-dNK和pLEGFP-dNK分别命名为803/dNK,803/dNKEGFP,823/dNK和823/dNKEGFP。　　 根据Dm-dNK的cDNA,在其两端设计出带EcoRI合XhoI的酶切位点的引物,利用聚合酶链式反应(PCR)将Dm-dNK克隆到质粒载体pENTER12中,质粒pENTER12包含有CMV启动子,多克隆位点和SV40 poly A尾,pENTER12-dNK与质粒PPE3-RC利用内切酶LR重组,并与增殖型腺病毒质粒pZD55共转染至腺转录病毒包装细胞HEK293细胞,9-14天后出现病毒空斑,利用DNA提取试剂盒抽提重组后病毒的DNA,通过PCR验证后命名为ZD55-dNK。复制缺陷5型腺病毒Ad-GFP用于比较不同细胞系间感染率的区别。　　 二、Dm-dNK基因的表达及酶活性的检测用TRIZOL方法提取纯化MGC-803,BGC-823,803/dNK和823/dNK以及感染腺病毒ZD55-dNK后的胃癌细胞系MGC-803,SGC-7901,正常细胞系GES-1和MRC-5,使用反转录PCR试剂盒对目的基因的表达进行检测。　　 酶活性测定通过提取细胞的蛋白,用放射性[3H]标记作为底物的核苷酸药物,混合液在Whatman DE-81滤纸上反应不同时间后经液闪测量仪测定放射活性。　　 三、Dm-dNK基因与核苷类似物联合对胃癌细胞的杀伤作用稳定转染的细胞803/dNK和823/dNK及未转染的对照细胞MGC-803和BGC-823铺板,加入不同浓度的ara-C,ara-T和CdA,共培养5天后采用MTT法检测细胞增殖情况。　　 胃癌细胞系MGC-803,SGC-7901以及正常细胞系GES-1和MRC-5铺板,培养基在第二天分别替换为病毒溶液ZD55-dNK,ZD55,DL1520,和WtAd,感染2天后,加入不同浓度的BVDU和ara-T,浓度为0,0.001,0.01,0.1,1,和10μM,共培养5天后采用MTT法检测细胞增殖情况。　　 采用Annexin V-FITC双染凋亡检测试剂盒观察治疗后细胞凋亡情况及凋亡比例。各种细胞铺6孔板加入核苷类药物处理,经Annexin V-FITC和碘化丙锭双重染色后用流式细胞仪分析凋亡比例。　　 四、Dm-dNK基因与核苷类似物联合对裸鼠移植瘤的抑制作用采用100-150 mm3裸鼠皮下种植肿瘤模型,6-8周龄的BALB/C裸鼠皮下注射转染的803/dNK细胞和对照MGC-803细胞.治疗组包括10只:5只MGC-803转移瘤,5只803/dNK转移瘤;所有治疗组动物在成瘤注射6天后腹腔给药ara-T治疗一个月。对照组包括8只:4只MGC-803转移瘤,4只803/dNK转移瘤,对照组动物成瘤注射6天后腹腔给PBS或ara-T。治疗条件满足后,裸鼠处死剥离瘤体根据公式(a2×6)/2测量瘤体积(为a短径).803/dNKEGFP转移瘤的裸鼠通过荧光体外成像观察Dm-dNK的表达。　　 五、重组腺病毒ZD55-dNK与BVDU联合对腺病毒的抑制作用将对数生长期的胃癌细胞MGC-803正常成纤维细胞MRC-5铺24孔板过夜,以MOI=1的病毒ZD55-dNK,ZD55,DL1520和WtAd5感染细胞2天,加入1μM的BVDU或ara-T处理3天。分别收集不同病毒处理的细胞及培养基,反复冻融裂解细胞释放病毒。梯度稀释病毒溶液,利用肾成纤维细胞293通过TCID50(tissue cultureinfectious dose)方法检测病毒滴度在药物处理前后的变化。　　 同样细胞经过病毒及药物的干预方法如上,利用细胞裂解液提取细胞蛋白,通过Western Blot蛋白杂交法检测病毒早期转录单位蛋白E1A在治疗前后的变化。　　 结果：　　 一、病毒载体的构建通过转染MCG-803细胞筛选出的803/dNKEGFP细胞发现融合Dm-dNK的荧光蛋白表达位置集中在细胞核。BGC-823也是如此。包装后的逆转录病毒在感染48小时后的荧光表达率接近100％。感染48小时后加入G418筛选出稳定表达的细胞株,MGC-803浓度为400μg/ml,BGC-823浓度为50μg/ml。　　 提取腺病毒ZD55-dNK的DNA利用PCR来鉴定病毒是否正确构建,电泳证实CMV启动子长度为521bp,Dm-dNK序列长度为779bp。细胞系对病毒的感染率由表达绿色荧光蛋白的野生5型腺病毒(Ad5-GFP)来确定。结果胃癌细胞系MGC-803和SGC-7901正常细胞系GES-1和MRC-5表现出基本相同的感染率。　　 二、Dm-dNK基因的表达及酶活性的检测提取稳定转染细胞803/dNK和823/dNK及未转染细胞MGC-803和BGC-823的mRNA,PCR及电泳后发现只有转染后的细胞有明显Dm-dNK的表达。溶瘤腺病毒ZD55-dNK感染的细胞中,胃癌细胞MGC-803和SGC-7901有明显。Dm-dNK的表达而正常细胞GES-1和MRC-5表达较低,可见腺病毒ZD55-dNK具有靶向性。　　 稳定转染细胞803/dNK和823/dNK(3857.47 pmol/mg/min)蛋白活性明显高于MGC-803和BGC-823(84.93 pmol/mg/min)。同样ara-C,ara-T和CdA在细胞803/dNK和823/dNK内的磷酸化程度也远远高于MGC-803和BGC-823。这些结果证明了Dm-dNK基因能够在胃癌细胞内稳定发挥激酶活性。　　 病毒ZD55-dNK感染后的胃癌细胞系MGC-803和SGC-7901蛋白活性明显高于没有感染病毒的空白细胞系,分别为25倍及50倍。病毒ZD55-dNK感染后正常细胞系GES-1和MRC-5酶活性低于感染后癌细胞系的10倍。这些结果证明了腺病毒ZD55-dNK能够在胃癌细胞中选择性表达并稳定发挥激酶活性。　　 三、Dm-dNK基因与核苷类似物联合对胃癌细胞的杀伤作用两株表达Dm-dNK的细胞(803/dNK823/dNK)表现出明显的药物敏感性,除了823/dNK细胞联合CdA。最敏感的是803/dNK细胞联合ara-T,在1-10μM ara-T的作用下仅有5％或更少的细胞存活率。而且,803/dNK和823/dNK细胞达到半数致死量所需ara-T的药物浓度比对照组所需药物剂量少了近800倍,其它核苷类似物底物敏感性较ara-T略弱。　　 Dm-dNK/核苷类似物系统对胃癌细胞的杀伤作用是通过凋亡方式介导细胞死亡。803/dNK和823/dNK细胞在1μM剂量ara-T作用下,凋亡细胞比例分别为75％和58％,相反的,MGC-803和BGC-823细胞在同剂量ara-T作用下,细胞凋亡比例为18％和22％。Dm-dNK/核苷类似物系统对胃癌细胞的杀伤作用是通过凋亡方式介导细胞死亡。　　 溶瘤腺病毒ZD55-dNK联合BVDU能够更有效的杀伤胃癌细胞,与不携带自杀基因的另外三种病毒相比,即使在极低的药物浓度作用下(0.01μM BVDU),然而在正常细胞中,ZD55-dNK所感染的细胞无论加或不加药物,均表现出较其它三种病毒更低的毒性,光镜下观察到的细胞病理效应(CPE)也证实了相同的结果,而且BVDU比ara-T对Dm-dNK的底物特异性更高。　　 四、Dm-dNK基因与核苷类似物联合对裸鼠移植瘤的抑制作用Dm-dNK/核苷类似物系统对转有Dm-dNK的胃癌细胞转移瘤803/dNK和823/dNK治疗后的体积为430±197 mm3和1068±227 mm3。而对照803/dNK转移瘤PBS处理组瘤体积为3325±506 mm3。肿瘤生长曲线表明,MGC-803转移瘤ara-T处理组与MGC-803转移瘤PBS处理组,及803/dNK转移瘤PBS处理组,在瘤体生长速度上没有统计学差异(P＞0.05所有观测时间点),然而803/dNK转移瘤ara-T处理组与以上几组相比,瘤体生长在治疗16-30天时明显被抑制(P＜0.05)。　　 五、重组腺病毒ZD55-dNK与BVDU联合可抑制腺病毒增殖TCID50方法检测病毒ZD55-dNK,ZD55,DL1520及WtAd感染后的胃癌细胞系MGC-803和正常细胞系MRC-5,加入不同浓度化疗药物BVDU和ara-T,检测加药前后的细胞及上清病毒滴度变化,在胃癌细胞中,ZD55-dNK联合BVDU治疗病毒滴度下降最为明显,与其它病毒滴度相比,降低接近1000倍。　　 Western Blot方法对病毒早期转录单位E1A的观察也证实了这一点,由于溶瘤病毒的选择性表达,ZD55-dNK感染后E1A仅在胃癌细胞中表达,ZD55-dNK联合BVDU使E1A表达明显降低,而ZD55或DL1520的E1A加药后变化不明显,而正常细胞中,除了野生型病毒在MRC-5中表达,溶瘤病毒的E1A条带显色不明显。　　 结论：　　 Dm-dNK激酶基因能够在胃癌细胞系MGC-803和BCG-823中高水平表达,并保持蛋白激酶活性。持续磷酸化作为底物的多种核苷酸类似物dThd,ara-C,ara-T和CdA表现出广泛底物特异性及高催化率。　　 我们构建的增殖型溶瘤腺病毒ZD55-dNK,能够使Dm-dNK特异性的在胃癌细胞系MGC-803和SGC-7901中高水平表达,并保持蛋白激酶活性。同时,溶瘤病毒的瘤裂解作用,配合Dm-dNK持续磷酸化作为底物的核苷酸类似物BVDU和ara-T,可通过凋亡方式导致肿瘤细胞死亡,对正常细胞影响甚微。　　 另外,在腺病毒联合BVDU对胃癌细胞的治疗过程中,毒性产物BVDU-TP不仅对胃癌细胞有杀伤作用,对增殖病毒本身也有抑制作用,尽管机制尚不明确,但是这种协同抑制作用有效的防止了病毒的过度的感染和播散,为有效干预胃癌发生、发展及临床上腺病毒应用的安全性提供有力的实验基础。　　 Dm-dNK/核苷类似物治疗体系可以作为一种新的自杀基因治疗方式,为有效干预胃癌发生、发展提供有力的实验基础。