目前,全世界不育夫妇占已婚夫妇的比例近15%,其中不育病因在男方的约占50%。导致男子不育的原因复杂广泛,精子发生障碍是主要的类型,主要表现为无精子症和少精子症。随着细胞遗传学和分子生物学领域的深入研究,越来越多的证据表明,精子的发生障碍与遗传因素有关,其中包括相关基因的突变。复杂而精细的精子发生和调控过程是一个由多基因参与的复杂过程。寻找影响精子发生的调节因子,阐明精子发生的调控机制,将为男性不育的治疗及探索男性节育新途径奠定理论基础。尽管精子发生是人与动物生命体内一个重要的生理过程,但长期以来由于缺乏合适的体内和体外研究模型,人们对精子发生过程分子机制的了解依然十分有限。因此一方面进一步研究已克隆的与精子发生相关基因的功能,另一方面充分利用现有的技术手段克隆相关的新基因并探讨其在精子发生过程中的作用,这不仅有助于阐明人类男性不育的分子机制,也为治疗男性不育症及开发新的避孕药物提供理论依据。为此本研究对几个与精子发生相关基因的功能进行了初步研究。内容共分为三个部分,其主要实验方法及实验结果如下：第一章人类精子发育相关新基因BCLT、GSSTP1、KLHL10、MET1、hGPAT4基因突变检测BCLT、GSSTP1、KLHL10、MET1、hGPAT4等基因都是近年来相继被克隆的与精子发育密切相关的新基因。但这些基因与特发性男性不育的相关程度如何,目前还不清楚,尚需进一步的研究。本研究首先通过收集临床上不明原因的无精、少精症患者血标本,抽提其DNA,建立了DNA样本库。然后采用PCR技术、变性高效液相色谱技术(DHPLC)以及测序等手段对DNA样本库中共计325份DNA样本以及正常人100份DNA样本进行上述几个基因的突变筛查。通过DHPLC检测12000余份PCR产物,发现8个新的未见报道的多态性位点；尚未发现有基因突变或缺失。因此,这五个基因的突变或缺失不是引起本组无精子症及少弱精子症病人的主要致病基因,该基因在男性不育症的诊断价值有待进一步确定。第二章小鼠生精细胞相关基因的克隆与功能的初步研究本研究从小鼠睾丸凋亡模型获得的其中一个EST BE644543出发,通过生物信息学分析和分子生物学实验,成功地克隆了小鼠生精细胞凋亡相关基因GPAT4及其人类同源基因hGPAT4。并对它们进行了初步的功能研究。生物信息学结果表明,GPAT4基因定位在小鼠8号染色体8A1.3.区带,其cDNA全长为3838 bp,其中含有1371bp的完整ORF,编码456个氨基酸,为胞浆中分泌性蛋白,具有磷酸酰基转移酶(PlsC)的结构域,属于酰基转移酶家族的成员,该家族成员具有脂质合成的功能。人类同源基因GPAT4基因定位在人8号染色体8 p11.21.区带,其cDNA全长为2592 bp,其中含有137lbp的完整ORF,编码456个氨基酸,也具有磷酸酰基转移酶(PlsC)的结构域,同属于酰基转移酶家族的成员。GPAT4在小鼠睾丸组织中高表达；采集小鼠不同发育阶段的睾丸总RNA进行半定量RT-PCR检测,结果显示GPAT4基因在出生小鼠2周时有微量表达,三周开始表达量逐步增大,在第五、六周表达量达到最大并在小鼠成年时期维持一个较高的表达水平；利用pEGFP-C3真核表达系统,观察到GPAT4编码蛋白表达于GC-1spg细胞系的细胞质当中,与生物信息学预测结果相同；将构建的pET-28a/ GPAT4原核表达质粒转化大肠杆菌,IPTG诱导后特异高效表达目的蛋白。原位杂交结果显示,代表阳性的棕黄色信号只出现在减数分裂时期才出现的精母细胞和圆形精子细胞,没有在有丝分裂时期的精原细胞或更晚的精子形成时期的长形精子细胞中发现阳性信号；构建真核表达载体pCDNA4/GPAT4/His转染GC-1spg细胞,结果显示GC-1spg生长速度加快,细胞周期分析表明G0／G1期细胞比例减少,S期细胞比例增多。这些结果表明GPAT4基因通过其催化生成的溶血磷脂酸在小鼠睾丸的精子发生过程中特别是在减数分裂时期发挥重要的作用。具体的分子机理有待作进一步的研究。第三章小鼠生精细胞基因mTSARG3功能的深入研究本研究所近期已克隆了一些小鼠睾丸生精细胞凋亡相关基因,但它们在生精过程中的具体作用仍然是不明确的。本研究的另一个任务就是对小鼠睾丸生精细胞凋亡相关基因mTSARG3功能进行深入研究。通过生物信息学分析表明,TSARG6和mTSARG3基因阅读框一致性高达85%,均包括8个外显子和7个内含子,其中中间6个外显子的长度完全相同,两者编码蛋白均为36KD,一致性高达89%。在对临床上特发性男性不育患者进行TSARG6基因突变筛查,结果发现一名隐睾症患者的该基因第2号外显子的第38位碱基T转变为C,为错义突变,从而导致第36个氨基酸由丝氨酸突变为脯氨酸。因此通过研究mTSARG3基因第2号外显子经定点突变后引起的蛋白质的改变,观察这种改变后的蛋白质所造成的一系列分子水平与细胞水平的功能改变,可以推测mTSARG3正常基因可能的相关功能。也为阐明人类同源基因TSARG6在生精过程中所起的作用奠定基础。本研究采用PCR定点诱变技术在mTSARG3基因第2号外显子第38位点构建mTSARG3突变基因,克隆入真核表达质粒pcDNA3.1/Hygro(-)。利用阳离子脂质体将重组质粒转染小鼠睾丸生精细胞系GC-1 spgo经潮霉素B压力筛选得到稳定转染细胞克隆,成功地构建了分别表达野生型mTSARG3基因和表达突变型mTSARG3基因突变体的GC-1 spg细胞系。应用包括western blot、热休克实验等在内的手段对细胞系的生物学特性进行了研究,探讨mTSARG3基因促进生精细胞的生长作用机理。Western blot结果显示,野生型和突变型的细胞系都表达了mTSARG3目的基因蛋白。热休克实验显示：mTSARG3基因突变型细胞系在热休克后细胞凋亡率较野生型细胞系没有显著性升高,未能显示mTSARG3基因有抗凋亡的作用。流式细胞技术分析表明,与未转基因或转染空白质粒的GC-1 spg细胞相比较,无论是野生型还是突变型mTSARG3基因在GC-1 spg细胞过表达后G1期细胞比例、S期和G2期细胞比例都没有明显的改变,说明mTSARG3基因没有通过调控细胞周期而促使细胞增殖。综上所述,本研究通过对BCLT、GSSTP1、KLHL10、MET1、GPAT4等基因进行突变筛查,发现9个新的未见报道的多态性位点,未发现有基因突变或缺失,因而说明这几个基因的突变不是引起本组无精子症及少弱精子症病人的主要致病基因,这些基因在男性不育症的诊断价值有待进一步确定；我们还从小鼠睾丸凋亡模型得到的一个EST出发,应用生物信息学和分子生物学实验克隆了两个基因GPAT4/hGPAT4。GPAT4主要在精母细胞和圆形精子细胞上表达,它们是酰基转移酶家族中的新成员,为甘油-3-磷酸酰基转移酶4,在睾丸组织中高表达,可催化产生溶血磷脂酸,后者具有丝裂原等多种生物活性来刺激细胞增殖,具体机理有待进一步研究；我们还对从小鼠睾丸凋亡模型克隆得到的mTSARG3基因(属于HSP40家族)通过构建点突变体来进行其功能研究。热休克实验表明过表达mTSARG3基因的野生型和突变型的细胞的凋亡率没有显著性差异,细胞周期中各期细胞的比例也没有很显著的差别,证明mTSARG3基因没有抗凋亡的作用。该基因编码的蛋白可能参与精子的发育而不是参与热休克应答。具体机理有待做进一步研究。