论文部分内容阅读
【研究背景】肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension,PAH)作为一种病情严重、进展迅速的肺血管疾病,以肺动脉压力持续增高为表现,伴肺血管重构及顺应性下降,可造成患者右心衰竭及死亡。目前PAH相关信号通路主要包括一氧化氮(nitric oxide,NO)、内皮素-1(endothelin-1,ET-1)及前列环素通路。基于此三种通路的靶向药物目前已在临床上用于治疗PAH,如外源性吸入NO、波生坦、安倍生坦及伊洛前列环素等,其机制主要通过扩张肺血管、降低肺动脉压力,从而提高PAH患者活动耐力,改善患者预后。上述治疗较大程度改善了患者病情,但不能从根本上有效控制PAH患者疾病进展。肺血管重构是PAH的关键病理特点,其重构的严重程度与患者预后密切相关。目前治疗PAH的靶向药物均不能有效控制肺血管重构。因此,寻找治疗PAH新的策略,成为进一步提高患者生存预后亟待解决的重要问题。NO作为重要的血管内皮源性舒张因子,由精氨酸在NO合成酶(nitric oxide synthase,NOS)催化下生成。NO进入细胞内激活鸟苷酸环化酶,促进三磷酸鸟苷转化为环磷酸鸟苷,抑制钙离子内流,引起肺动脉平滑肌舒张,进而降低肺动脉压力。目前外源性吸入NO已被批准临床应用于新生儿严重持续性肺高压、心脏大血管术后相关PAH及严重呼吸衰竭相关PAH等疾病。然而,NO作用时间短暂,需要持续吸入,且治疗窗非常窄(5-20 ppm),存在毒副作用,包括可导致高铁血红蛋白血症及有毒物质二氧化氮产生等。NO供体是一种可在体内释放NO的化合物。目前研究发现NO供体具有治疗PAH的潜力,被认为可作为外源性吸入NO治疗PAH的替代策略。吸入NO供体在肺组织可缓慢释放NO,选择性扩张肺血管,降低肺动脉压,且作用时间较吸入NO持久,避免NO过快释放引起的毒副作用。因此,NO供体为治疗PAH提供了的新策略。2-Cyano-3,12-dioxooleana-1,9(11)-dien-28-oic acid(CDDO)methyl ester(CDDO-Me),中文称“甲基巴索多隆”,是一种半合成的齐墩果酸衍生物。研究发现CDDO-Me通过激活核因子-红细胞-2相关因子(nuclear factor erythroid 2related factor 2,Nrf2)及抑制核因子-κ(nuclear factor-kappa,NF-κ)发挥抗氧化、抗炎及抗纤维化效应,具有保护血管内皮细胞及抑制新生血管形成的作用。此外,CDDO-Me可改善细胞线粒体功能。鉴于CDDO-Me具有上述功能,其被用于II期临床试验,初步结果显示CDDO-Me可有效改善PAH患者运动耐力,提示CDDO-Me具有治疗PAH的应用前景,然而CDDO-Me并没有直接的扩张肺血管效应。PAH的病理生理机制复杂性决定了单一的扩张肺血管对改善PAH患者预后作用有限,而联合应用具有降低肺动脉压力及有效抑制肺血管重构的“双重效应”的治疗手段较单一治疗可更有效的改善PAH。在本研究中,我们将对基于CDDO-Me与单硝酸异山梨酯的化学结构特点及“前药理论”设计并合成具有抗炎、抗氧化作用的新型NO供体型CDDO-Me衍生物(命名为CDDO-NO)的细胞生物学效应、药代动力学特点、对PAH的作用及其相关的机制进行研究,为治疗PAH提供新的策略。第一部分CDDO-NO对两种肺血管结构细胞生物学效应及其药代动力学研究【目的】了解CDDO-NO对两种人肺血管结构细胞生物学效应,及其在大鼠体内的药代动力学特点。【方法】1.Cell Counting Kit(CCK-8)及Ed U实验方法分别检测CDDO-NO与CDDO-Me对肺动脉内皮细胞(pulmonary artery endothelial cells,PAECs)及肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth cells,PASMCs)的活力及增殖的影响。2.Transwell迁移实验了解CDDO-NO对PAECs及PASMCs的迁移影响。3.免疫荧光方法检测CDDO-NO和CDDO-Me对PAECs的Nrf2蛋白活化与钙黏蛋白(vascular endothelial-cadherin,VE-cadherin)的影响。4.用荧光探针(2’,7’-二氯荧光黄双乙酸盐,DCFH-DA)检测CDDO-NO和CDDO-Me对缺氧条件下PAECs活性氧产生的影响。5.大鼠气道内缓慢注射CDDO-NO(100μL,1 mg/m L)及CDDO-Me(100μL,1 mg/m L),在不同时间点收集大鼠肺组织及血浆,用质谱分析方法检测CDDO-NO及CDDO-Me在肺组织及血浆中的浓度分布,分析其药代动力学特点。【结果】1.CDDO-NO及CDDO-Me对PAECs和PASMCs细胞活力的影响呈时间-浓度依赖性。CDDO-Me对上述两种细胞活力及增殖的影响要明显于CDDO-NO,此外CDDO-NO对PASMCs活力及增殖的影响要明显于PAECs。2.CDDO-NO可选择性抑制PASMCs迁移。3.CDDO-NO可活化Nrf2蛋白,与CDDO-Me比较对PAECs细胞的VE-cadherin的表达影响低。4.CDDO-NO可有效抑制缺氧条件下PAECs活性氧的生成。5.药代动力学特点:CDDO-NO在肺组织中60 min时达到峰浓度(243 ng/m L),在180 min时,仍能检测到CDDO-NO。CDDO-NO的水解产物CDDO-Me,在肺组织中90 min达到峰浓度(78.5 ng/m L),在12 h时,肺组织中仍能检测到CDDO-Me的表达。CDDO-Me气道内给药后在肺组织种60 min达到高峰,但其浓度很快下降,在360 min时基本检测不到。【结论】1.CDDO-NO对两种肺血管结构细胞生物学效应影响较CDDO-Me低,且对PASMCs的影响较PAECs显著,且可保护血管内皮细胞。2.CDDO-NO在大鼠肺组织内可缓慢释放CDDO-Me及NO,是一种新型的NO供体型CDDO-Me衍生物。第二部分吸入CDDO-NO对野百合碱诱导的大鼠肺动脉高压的作用【目的】应用PAH动物模型,探讨吸入CDDO-NO对野百合碱诱导的大鼠肺动脉高压的作用及其可能机制。【方法】1.建立野百合碱(monocrotaline,MCT)诱导雄性sprague dawley(SD)大鼠PAH模型。应用口鼻暴露式雾化吸入专用装置给予大鼠每日雾化给药:CDDO-NO、CDDO-Me、单硝酸异山梨酯(isosorbide mononitrate,ISMN)、ISMN联合CDDO-Me。用微型导管测定右心室收缩压(right ventricular systolicpressure,RVSP)及肺动脉平均压(mean pulmonary arterial pressure,m PAP)。分离右心室(RV)、室间隔与左心(LV+S),计算右心室肥厚指数(RV/LV+S)。2.酶联免疫吸附测定方法和Griess法分别检测大鼠血浆中ET-1和总NO水平。3.组织病理学实验方法,包括苏木素-伊红染色、马松染色、天狼星红染色、免疫组织化学方法等,检测PAH肺血管重构及右心室形态学变化。【结果】1.给予PAH大鼠每日雾化吸入CDDO-NO(3μg/kg),持续吸28天,有效降低m PAP、RVSP及RV/LV+S,而单独吸入CDDO-Me、ISMN及CDDO-Me联合ISMN并不能有效改善PAH大鼠肺循环血流动力学。2.CDDO-NO显著升高PAH大鼠血浆NO水平,并可降低血浆ET-1水平。3.CDDO-NO有效改善PAH大鼠肺血管中膜层肥厚,抑制肺小血管肌化及I型胶原蛋白与转化生长因子-β(transforming growth factor-beta,TGF-β)的表达。4.CDDO-NO可减少PAH大鼠肺小血管周围增殖细胞核抗(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)阳性细胞及巨噬细胞浸润,并可抑制肺血管周围细胞氧化应激反应。5.CDDO-NO有效改善PAH大鼠心肌细胞肥大及纤维化。【结论】1.CDDO-NO显著改善PAH大鼠肺循环血流动力学。2.CDDO-NO有效抑制PAH大鼠肺血管重构及右心室重构。3.CDDO-NO是一种新型的NO供体型CDDO-Me衍生物,为治疗PAH提供了新的策略。