研究背景长链非编码RNA(Long noncoding RNA,LncRNA)H19是最早发现的lncRNA之一,首次在小鼠和人类肝脏中发现,是人体在胎儿期和成人期表达差异最大的lncRNA。H19在胆汁淤积性肝纤维化组织中表达增高,,且其过表达可加重胆汁淤积性肝纤维化的病变进展。肝纤维化的发病机制是多种炎性细胞因子如转化生长因子β1(Transforming growth factor beta 1,TGFβ1)等分泌增多,导致肝星状细胞(Hepatic stellate cells,HSCs)活化,细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)合成增多。HSCs活化是肝纤维化发生发展的中心环节。自噬可以促进HSCs活化。H19参与了自噬的调控,其过表达可加重HSCs的活化。胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白1(Insulin-like growth factor binding protein-related protein 1,IGFBPrP1)是导师课题组十余年来研究发现的一种新的致肝纤维化因子。前期一系列研究表明,IGFBPrP1能够活化HSCs,产生过多的ECM,促进肝纤维化的发生发展。另外,IGFBPrP1和TGFβ1可以相互调节,共同促进HSCs活化。TGFβ1可以通过自噬促进HSCs活化,PI3K/AKT信号通路参与其中。TGFβ1也能促进H19的表达,其机制可能与PI3K/AKT的活化有关。鉴于TGFβ1与H19和自噬有关,而IGFBPrP1与TGFβ1可互为因果,那么,IGFBPrP1在诱导肝纤维化过程中,H19与自噬的表达如何,是否对其具有调控作用,PI3K/AKT/mTOR信号通路是否参与其中,目前国内外尚未报道。为此,本研究拟以长链非编码RNA H19和自噬作为切入点,研究H19是否通过自噬调控IGFBPrP1致肝纤维化形成的作用及其机制。实验分为两大部分:第一部分首先是验证经典模型BDL致小鼠肝纤维化形成过程中,是否存在H19、自噬以及IGFBPrP1的改变;其次研究IGFBPrP1诱导小鼠肝纤维化形成过程中是否有H19与自噬的改变。第二部分是通过体外实验首先研究IGFBPrP1过表达JS-1(小鼠肝星状细胞株)后,H19与自噬的表达变化特点;其次研究上调或下调H19是否会对自噬产生影响,该影响是否会调控IGFBPrP1诱导的肝星状细胞活化,并阐明其可能机制。第一部分小鼠肝纤维化形成中IGFBPrP1对长链非编码RNA H19与自噬的影响实验一胆总管结扎致小鼠肝纤维化形成中H19与自噬的动态变化目的:观察胆总管结扎(BDL)致小鼠肝纤维化形成过程中H19与自噬的动态变化。方法:C57BL/6野生雄性小鼠88只随机分为三组:正常组:正常饲养;伪手术组:仅分离胆总管而不结扎;BDL组:分离并结扎胆总管。三组动物分别于2w、4w、6w末各取8只麻醉后留取肝组织,HE染色观察肝脏病理学改变,免疫组化及Western blot方法检测IGFBPrP1、TGFβ1、α-SMA、collagen I、LC3B、Beclin1、SQSTM1/p62蛋白表达,qRT-PCR检测IGFBPrP1、lncRNA H19的表达。结果:(1)HE染色:BDL作用于小鼠后,随着病变进展,肝细胞减少,汇管区扩大,胆管扩张,小胆管增生,胶原增生和沉积,病变随着时间延长而加重。(2)免疫组化及Western blot方法检测IGFBPrP1等蛋白表达:BDL作用于小鼠后,肝组织中IGFBPrP1、TGFβ1、α-SMA、collagen I蛋白表达随着肝纤维化进展逐渐升高(P<0.05)。(3)免疫组化及Western blot方法检测LC3B、Beclin1、SQSTM1/p62蛋白表达:BDL作用于小鼠后,肝组织蛋白表达LC3B、Beclin1随着肝纤维化进展逐渐升高(P<0.05),而SQSTM1/p62表达逐渐降低(P<0.05)。(4)肝组织IGFBPrP1与LC3B、Beclin1、SQSTM1/p62蛋白表达的相关性:在BDL作用的小鼠肝组织中,IGFBPrP1与LC3B、Beclin1、SQSTM1/p62的相关系数分别为r=0.948,0.955,0.953,P<0.01。IGFBPrP1与LC3B、Beclin1呈正相关关系,与SQSTM1/p62呈负相关关系。(5)qRT-PCR检测IGFBPrP1、lncRNA H19的表达:BDL作用于小鼠后,肝组织中IGFBPrP1 mRNA随着肝纤维化进展逐渐升高(P<0.05),H19 RNA表达也逐渐增高(P<0.05)。(6)肝组织IGFBPrP1 mRNA与H19 RNA表达的相关性:在BDL作用的小鼠肝组织中,IGFBPrP1与H19的相关系数分别为r=0.930,P<0.01。IGFBPrP1与H19呈正相关关系,结论:胆总管结扎致小鼠肝纤维化形成中,IGFBPrP1与H19、自噬均表达增高。实验二IGFBPrP1致小鼠肝纤维化形成中自噬与长链非编码RNA H19的动态变化目的:研究IGFBPrP1过表达致小鼠肝纤维化形成过程中自噬与长链非编码RNAH19的动态变化。方法:C57BL/6野生雄性小鼠144只随机分为三组:Control组:尾静脉注射0.1ml生理盐水;CAd组:尾静脉注射空病毒2×109pfu/只0.1ml;AdIGFBPrP1组:尾静脉注射AdIGFBPrP1基因2×109pfu/只0.1m。分别于1w、2w、4w、8w、12w末各取8只麻醉后留取血清及肝组织,ELISA检测血清ALT、AST表达,HE及Sirius red染色观察肝脏病理学改变,免疫组化及Western blot方法检测IGFBPrP1、TGFβ1、α-SMA、collagen I、LC3B、Beclin1、SQSTM1/p62、Atg5、Atg7蛋白表达,qRT-PCR方法检测IGFBPrP1、α-SMA、LC3B、H19的表达。结果:(1)荧光显微镜观察EGFP表达:AdIGFBPrP1转染小鼠1w后,肝组织可见明亮绿色荧光,2w时绿色荧光减弱,4w时可见微弱的绿色荧光。(2)ELISA检测ALT、AST:AdIGFBPrP1转染小鼠1w后,ALT、AST迅速升高,2w、4w逐渐下降,8w、12w降至正常。(3)HE和Sirius red染色:AdIGFBPrP1转染小鼠后,随着时间延长,肝组织炎性细胞浸润,肝细胞肿胀,胞浆疏松,肝细胞变性、坏死,汇管区胶原纤维逐渐增生。(4)免疫组化及Western blot方法检测IGFBPrP1等蛋白表达:AdIGFBPrP1转染小鼠后,肝组织中IGFBPrP1蛋白表达于1w达高峰,2w、4w、8w逐渐下降,12w降至正常(P<0.05)。TGFβ1、α-SMA、collagen I蛋白表达随着时间延长逐渐升高(P<0.05)。(5)免疫组化及Western blot方法检测LC3B、Beclin1、SQSTM1/p62、Atg5、Atg7蛋白表达:AdIGFBPrP1转染小鼠后,肝组织中LC3B、Beclin1、Atg5、Atg7蛋白表达于1w达高峰,2w、4w、8w、12w略降低(P<0.05)。而SQSTM1/p62在1w降至最低,2w、4w、8w、12w略升高(P<0.05)。(6)qRT-PCR检测IGFBPrP1、α-SMA、LC3B、lncRNAH19的表达:AdIGFBPrP1转染小鼠后,IGFBPrP1 mRNA于1w达高峰,2w、4w、8w逐渐下降,12w降至正常(P<0.05),α-SMA mRNA随着时间延长逐渐增高(P<0.05),LC3B mRNA于1w达高峰,2w、4w、8w、12w略降低(P<0.05),H19 RNA于1w达高峰,2w、4w、8w、12w略降低(P<0.05)。结论:IGFBPrP1过表达致小鼠肝纤维化形成过程中可促进自噬和H19的表达。实验三上调或下调自噬对IGFBPrP1致小鼠肝纤维化形成的影响目的:明确IGFBPrP1是否能通过自噬诱导小鼠肝纤维化。方法:C57BL/6野生雄性小鼠200只随机分为五组:Control组:尾静脉注射0.1ml生理盐水;CAd组:尾静脉注射空病毒2×109pfu/只0.1ml;AdIGFBPrP1组:尾静脉注射AdIGFBPrP1 2× 109pfu/只0.1ml;AdIGFBPrP1+LY294002组:尾静脉注射AdIGFBPrP1 2×109pfu/只0.1ml,同时腹腔注射LY294002(4mg/kg/d);AdIGFBPrP1+雷帕霉素组:尾静脉注射AdIGFBPrP1 2×109pfu/只0.1ml,同时腹腔注射雷帕霉素(2mg/kg/d),分别于1w、2w、4w、8w、12w采集标本及检测,HE和Sirius red染色观察肝脏病理学变改变,免疫组化及Western blot方法检测IGFBPrP1、TGFβ1、α-SMA、collagen I、LC3B、Beclin1、SQSTM1/p62、Atg5、Atg7、p-AKT、p-mTOR蛋白表达,qRT-PCR方法检测IGFBPrP1、α-SMA、LC3B表达。结果:(1)HE和Sirius red染色:在AdIGFBPrP1致小鼠肝纤维化过程中,腹腔注射LY294002,肝细胞变性、坏死较轻,胶原纤维增生较少。腹腔注射雷帕霉素后,炎性细胞增多,肝细胞变性、坏死严重,胶原纤维增多。(2)免疫组化及Western blot方法检测肝组织LC3B、Becli1、SQSTM1/p62、Atg5、Atg7蛋白表达:在AdIGFBPrP1致小鼠肝纤维化过程中,腹腔注射LY294002,肝组织中LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ比值及Beclin1、Atg5、Atg7蛋白表达均降低(P<0.05),SQSTM1/p62蛋白表达增多(P<0.05)。腹腔注射雷帕霉素,肝组织LC3Ⅱ/LC3 Ⅰ比值及Beclin1、Atg5、Atg7蛋白表达均增高(P<0.05),SQSTM1/p62蛋白表达降低(P<0.05)。(3)免疫组化及Western blot方法检测肝组织α-SMA、collagen Ⅰ蛋白表达:在AdIGFBPrP1致小鼠肝纤维化过程中,腹腔注射LY294002,肝组织α-SMA、collagen Ⅰ蛋白表达相对减少(P<0.05)。腹腔注射雷帕霉素,肝组织α-SMA、collagen Ⅰ蛋白表达增多(P<0.05)。(4)Western blot方法检测肝组织p-AKT、p-mTOR蛋白表达:AdIGFBPrP1可抑制AKT和mTOR的磷酸化水平,腹腔注射LY294002或雷帕霉素,可进一步抑制AKT和mTOR的磷酸化水平(P<0.05)。(4)qRT-PCR检测IGFBPrP1、α-SMA、LC3B表达:在AdIGFBPrP1致小鼠肝纤维化过程中,腹腔注射LY294002,IGFBPrP1、α-SMA、LC3B mRNA表达减少(P<0.05)。腹腔注射雷帕霉素,IGFBPrP1、α-SMA、LC3B mRNA表达增多(P<0.05)。结论:IGFBPrP1可通过自噬诱导小鼠肝纤维化。实验四IGFBPrP1致小鼠肝纤维化形成中自噬对长链非编码RNA H19的调控作用目的:探讨IGFBPrP1致小鼠肝纤维化形成中,抑制或促进自噬对H19的影响。方法:实验分组同实验三。qRT-PCR检测H19 RNA表达。结果:(1)qRT-PCR检测小鼠肝组织H19 RNA表达:在IGFBPrP1致小鼠肝纤维化过程中,LY294002明显抑制H19 RNA表达(P<0.05),雷帕霉素增强了H19 RNA表达(P<0.05)。结论:IGFBPrP1致小鼠肝纤维化形成中,改变自噬可影响H19的表达,其与IGFBPrP1影响PI3K/AKT/mTOR信号通路有关。第二部分 长链非编码RNA H19与自噬在IGFBPrP1过表达JS-1(小鼠肝星状细胞株)中的作用及其机制研究实验五长链非编码RNA H19与自噬在IGFBPrP1过表达JS-1中的动态变化目的:探讨IGFBPrP1过表达JS-1后,H19与自噬的变化特点。方法:首先用不同MOI(10,50,100,200)的AdIGFBPrP1转染JS-1细胞,筛选出最适MOI,用于后续实验。实验分三组:Control组:未做处理;CAd组:空病毒转染细胞;AdIGFBPrP1组:AdIGFBPrP1转染细胞。分别于6h、12h、24h、48h、72h收集细胞,Western blot检测IGFBPrP1、α-SMA、collagen I、LC3B、Beclin1、SQSTM1/p62蛋白表达。qRT-PCR检测IGFBPrP1、α-SMA、LC3B、H19的表达。结果:(1)最适MOI确定:AdIGFBPrP1 MOI 100的转染效率明显高于MOI 10、MOI 50、MOI 200(P<0.05)。(2)Western blot方法检测IGFBPrP1、α-SMA、collagen I蛋白表达:AdIGFBPrP1转染JS-1后,IGFBPrP1蛋白表达在6h、12h、24h逐渐增多,48h达高峰,72h降低(P<0.05)。α-SMA、collagen I蛋白表达随着时间推移逐渐增多(P<0.05)。(3)Western blot方法检测LC3B、Beclin1、SQSTM1/p62表达:AdIGFBPrP1转染JS-1后,LC3B、Beclin1蛋白表达在6h、12h、24h逐渐增多,48h达高峰,72h降低(P<0.05)。SQSTM1/p62在6h、12h、24h逐渐降低,48h降至最低,72h增高(P<0.05)。(4)qRT-PCR检测IGFBPrP1、α-SMA、LC3B、H19表达:AdIGFBPrP1转染JS-1后,IGFBPrP1、LC3B mRNA表达量在6h、12h、24h逐渐增多,48h达高峰,72h降低(P<0.05)。α-SMA mRNA表达量随着时间推移逐渐增多(P<0.05)。H19 RNA表达量在6h、12h、24h逐渐增多,48h达高峰,72h降低(P<0.05)。结论:IGFBPrP1过表达JS-1后,H19与自噬的表达增高。实验六上调或下调自噬对IGFBPrP1过表达JS-1合成ECM(细胞外基质)的影响目的:明确抑制或促进自噬是否会影响IGFBPrP1对HSCs活化及ECM合成。方法:实验分组如下:Control组:正常培养;CAd组:空病毒转染细胞48h;AdIGFBPrP1组:MOI 100的AdIGFBPrP1转染细胞48h;AdIGFBPrP1+LY294002组:MOI100的AdIGFBPrP1转染细胞48h,LY294002 10μmol/L、20μmol/L、25 μmol/L转染细胞24h;AdIGFBPrP1+雷帕霉素组:MOI 100的AdIGFBPrP1转染细胞48h,雷帕霉素100nmol/L转染细胞24h,所有细胞均使用10%FBS培养基培养。Western blot检测IGFBPrP1、α-SMA、collagen I、LC3B、Beclin1、SQSTM1/p62、p-AKT、p-mTOR蛋白表达。qRT-PCR检测IGFBPrP1、α-SMA、LC3B mRNA的表达。结果:(1)Western blot方法检测LC3B、Beclin1、SQSTM1/p62蛋白表达:在AdIGFBPrP1转染的基础上,LY294002低、中、高剂量干预后,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值及Beclin1蛋白表达均降低(P<0.05),SQSTM1/p62蛋白表达增多(P<0.05),其中LY294002高剂量组对自噬的抑制作用更为显著(P<0.05)。雷帕霉素干预后,LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ比值及Beclin1蛋白表达均增高(P<0.05),SQSTM1/p62蛋白表达降低(P<0.05)。(2)Western blot方法检测IGFBPrP1、α-SMA、collagen Ⅰ蛋白表达:在AdIGFBPrP1转染的基础上,LY294002低、中、高剂量干预后,IGFBPrP1、α-SMA、collagen Ⅰ蛋白表达均降低(P<0.05),其中LY294002高剂量组的抑制作用更为显著(P<0.05)。雷帕霉素干预后,IGFBPrP1、α-SMA、collagen Ⅰ蛋白表达均增高(P<0.05)。(3)Western blot方法检测p-AKT、p-mTOR蛋白表达:AdIGFBPrP1转染JS-1后,可抑制AKT、mTOR的磷酸化水平,LY294002低、中、高剂量干预后,AKT和mTOR的磷酸化水平进一步降低(P<0.05),其中LY294002高剂量组的抑制作用更为显著(P<0.05)。雷帕霉素干预后,AKT和mTOR的磷酸化水平亦进一步降低(P<0.05)。(4)qRT-PCR检测IGFBPrP1、α-SMA、LC3B mRNA表达:在AdIGFBPrP1转染的基础上,高剂量LY294002可明显抑制IGFBPrP1、LC3B、α-SMA mRNA表达(P<0.05),雷帕霉素增强了IGFBPrP1、LC3B、α-SMA mRNA表达(P<0.05)。结论:IGFBPrP1可通过自噬促进HSCs活化,ECM合成增多。实验七IGFBPrP1过表达JS-1中改变自噬对长链非编码RNA H19的影响目的:探讨IGFBPrP1活化HSCs过程中,改变自噬对H19表达的影响。方法:实验分组同实验六。qRT-PCR检测H19 RNA表达。结果:(1)qRT-PCR检测JS-1中H19 RNA表达:在AdIGFBPrP1转染基础上,LY294002明显抑制H19 RNA表达(P<0.05),雷帕霉素增强了H19 RNA表达(P<0.05)。结论:IGFBPrP1活化HSCs过程中,改变自噬可影响H19的表达,该作用可能与PI3K/AKT/mTOR信号通路有关。实验八上调或下调长链非编码RNA H19对IGFBPrP1过表达JS-1中自噬的调控作用目的:探讨上调或下调H19如何影响IGFBPrP1诱导的HSCs自噬及活化。方法:实验分六组:Control组:正常培养;AdIGFBPrP1组:MOI 100的AdIGFBPrP1转染细胞48h;AdIGFBPrP1+pcDNA3.1-H19组:转染pcDNA3.1-H196h后换用MOI100的AdIGFBPrP1转染细胞48h;AdIGFBPrP1+pcDNA3.1-control组:转染pcDNA3.1-control 6h后换用MOI 100的AdIGFBPrP1转染细胞48h;AdIGFBPrP1+siRNA-H19组:转染siRNA-H19 6h后换用MOI 100的AdIGFBPrP1转染细胞48h;AdIGFBPrP1+siRNA-NC组:转染siRNA-NC 6h后换用MOI 100的AdIGFBPrP1转染细胞48h。所有细胞均使用10%FBS培养基培养。Western blot方法检测α-SMA、collagen I、LC3B、Beclin1、SQSTM1/p62蛋白表达;qRT-PCR检测H19、IGFBPrP1、α-SMA、LC3B mRNA表达。结果:(1)Western blot方法检测LC3B、Beclin1、SQSTM1/p62蛋白表达:在AdIGFBPrP1转染的基础上,pcDNA3.1-H19可升高LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ比值及Beclin1蛋白表达(P<0.05),而降低SQSTM1/p62蛋白表达(P<0.05)。siRNA-H19可降低LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ比值及Beclin1蛋白表达(P<0.05),而升高SQSTM1/p62蛋白表达(P<0.05)。(2)Western blot方法检测α-SMA、collagen Ⅰ蛋白表达:在AdIGFBPrP1转染的基础上,pcDNA3.1-H19可升高α-SMA、collagen Ⅰ蛋白表达(P<0.05)。siRNA-H19可降低α-SMA、collagen Ⅰ蛋白表达(P<0.05)。(3)qRT-PCR检测H19 RNA、α-SMA、LC3B mRNA表达:在AdIGFBPrP1转染的基础上,pcDNA3.1-H19可升高H19、α-SMA、LC3B RNA表达(P<0.05)。siRNA-H19可降低H19、α-SMA、LC3B RNA表达(P<0.05)。结论:上调H19可促进IGFBPrP1诱导的HSCs自噬及活化;下调H19可抑制IGFBPrP1诱导的HSCs自噬及活化。