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破伤风梭菌产生的破伤风毒素,经0.4%甲醛灭活后,失去毒性而仍保留抗原性称之为破伤风类毒素。类毒素精制后,可作为疫苗对人和动物进行免疫接种。但机体感染后不能获得终身免疫力,且此免疫程序较长。为了减轻接种的副反应,提高免疫效果,减少注射次数,提高接种覆盖率,本研究采用原核细胞表达具有高免疫原性的重组C蛋白,用于生产疫苗及免疫接种,以避免出现副作用;另外,用双功能交联剂戊二醛聚合破伤风毒素,使毒素分子之间进行交联,从而产生分子量较大的,表面决定簇多的聚合类毒素。该类毒素作为免疫的抗原,可以诱发较高的抗体水平,加强免疫记忆,延长保护机体免受破伤风的侵害的时间。1.利用PCR技术从破伤风梭菌基因组DNA中扩增出1 356 bp的破伤风毒素C基因,将该基因片段插入到表达载体pET32a(+)中,转化宿主菌BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达,观察各种条件下对重组菌蛋白表达的影响。对重组后蛋白用Ni-NAT亲和层析的技术纯化C融合蛋白,然后进行小鼠免疫实验并测定效价。研究显示:经SDS-PAGE分析,重组破伤风毒素C蛋白(rTTC)的表达量占可溶性蛋白的28.19%,纯化后得到蛋白纯度为96.92%。免疫印迹证实该重组蛋白是破伤风毒素C蛋白抗原,对小鼠免疫,三免后14 d rTTC组小鼠抗体效价仍能达到1∶16 000。所获得的重组蛋白具有良好的免疫原性。2.经过厌氧培养的破伤风梭菌,产毒后进行脱毒、精制,在产毒期间进行毒力鉴定、解毒和毒性逆转实验。再由戊二醛聚合破伤风类毒素,经不同的聚合条件的优化,进行分子量和Lf的测定,然后免疫小鼠和兔子,并测定其免疫效价。培养的毒素可以作为制备类毒素使用,脱毒精制后的类毒素,经毒力鉴定试验、解毒试验和毒性逆转试验检测后均合格。用pH 7.2的PBS稀释类毒素,终浓度为0.1%、0.3%戊二醛置于室温中聚合稀释后的类毒素12 h,聚合类毒素中聚合的类毒素分子量为600 ku,含量占聚合物的43.82%,经ELISA检测抗原性,抗原与阳性血清呈阳性反应。免疫小鼠和兔子,平均效价在1∶2 0 000～1∶3 0 000。所得到的聚合类毒素具有抗原性及免疫原性。3.最后将聚合类毒素和未聚合类毒素分别与重组抗原联合免疫马匹,未聚合类毒素的平均效价明显低于聚合类毒素组别,说明在联合免疫后,聚合类毒素可以提高马匹的血清效价。