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背景与研究目的宫颈癌是女性生殖器官最常见的恶性肿瘤，全世界每年有50多万人患病，其中80％在发展中国家，严重威胁妇女的健康和生命。尽管宫颈癌的治疗取得了巨大进展，但晚期患者5年生存率仅为50％左右。生物治疗已成为目前肿瘤治疗的研究热点，但多以凋亡诱导为主，将自噬性细胞死亡引入肿瘤治疗，可能成为新的治疗靶点。程序性细胞死亡可以分为凋亡和自噬两种方式，自噬作为Ⅱ型程序性细胞死亡，具有特殊的形态学改变和独有的调控通路，与凋亡截然不同。自噬是正常细胞的功能，是真核细胞蛋白降解的重要途径，是维持细胞自我平衡的重要机制，自噬异常与肿瘤形成有关。近来，随着人类自噬基因Beclin 1的克隆成功，进一步了解自噬在人类肿瘤中的作用，探索自噬调控通路，明晰自噬与凋亡的相互关系，成为目前的研究热点。Beclin 1是新近克隆的哺乳动物的自噬调控基因，位于染色体17q21，在75％的卵巢癌，50％的乳腺癌和40％的前列腺癌中表现为单等位基因缺失，是候选的肿瘤抑制基因。关于Beclin 1与宫颈癌的相关性研究，目前尚未见到报道。本课题旨在研究自噬基因Beclin 1在宫颈癌组织中的表达，Beclin 1基因表达质粒及特异性RNA干扰质粒分别在体内、体外对宫颈癌HeLa细胞生长、凋亡、自噬的影响，探索自噬诱导在宫颈癌治疗中的可行性，为宫颈癌的基因治疗提供新的靶点。方法通过免疫组化SP法检测Beclin 1蛋白在宫颈癌组织中的表达；通过目的基因克隆、载体构建，RNA干扰技术，构建Beclin 1基因表达质粒pcDNA3.1(+)—Beclin 1和RNA干扰质粒pSUPER—Beclin 1，分别观察它们在体内、外对宫颈癌HeLa细胞生长、自噬和凋亡的影响：1．采用免疫组化SP法检测Beclin 1基因在宫颈癌组织(n=81)、CIN组织(n=20)、正常宫颈组织(n=20)中的表达状况，分析Beclin 1与宫颈癌临床分期、病理分级、淋巴结转移等临床病理因素的相关性；2．通过RT-PCR方法，从人正常卵巢组织中获得Beclin 1基因，构建Beclin 1基因的真核表达质粒pcDNA3.1(+)—Beclin 1；采用计算机软件设计针对Beclin 1的特异性RNA干扰序列，构建Beclin 1基因的小发夹状RNA(shRNA)真核表达质粒pSUPER—Beclin 1；3．利用脂质体将重组质粒pcDNA3.1(+)—Beclin 1和pSUPER—Beclin 1转染HeLa细胞，筛选稳定表达株，以荧光定量RT-PCR检测转染前后Beclin 1及caspase-9 mRNA的变化，以western blot检测转染前后Beclin 1及caspase-9蛋白的变化；采用流式细胞仪检测细胞周期、凋亡、自噬的变化；电镜检测自噬泡的形成，MDC染色检测自噬体的数量；MTT法检测细胞的增殖变化；4．将上述两株稳定表达株分别接种到裸鼠皮下成瘤，建立雌性裸鼠异体移植宫颈癌模型，观察瘤体生长速度及瘤体大小，免疫组化检测瘤体组织中Beclin 1蛋白的表达。采用，检验和x~2检验进行统计学分析。结果1．宫颈癌组织中Beclin 1的蛋白表达阳性率低于正常宫颈和CIN组织(P＜0.05)，宫颈癌中常见Beclin 1表达下调和缺失；正常宫颈与CIN间Beclin 1的表达无显著性差异(P＞0.05)；2．Beclin 1表达与宫颈癌的临床分期、病理类型、宫颈浸润深度、宫颈肿瘤大小、肿瘤大体类型均无相关性(P＞0.05)；在高中分化组中Beclin 1的蛋白表达率高于低分化组，在有淋巴结转移组表达率低于无淋巴结转组(P＜0.05)；新辅助化疗前后Beclin 1蛋白的表达无显著性差异(P＞0.05)：3．利用PCR分析，酶切鉴定及DNA测序证实Beclin 1基因的表达质粒pcDNA3.1(+)—Beclin 1和RNA干扰质粒pSUPER—Beclin 1构建成功；4．Beclin 1基因表达质粒pcDNA3.1(+)—Beclin 1转染HeLa细胞后，Beclin 1、caspase-9 mRNA和蛋白的表达显著提高(P＜0.05)，与未转染组相比，G1期细胞比例明显增多，S期细胞比例明显降低，凋亡细胞和自噬细胞明显增加，并促进了自噬泡的形成，细胞生长活性降低；5．Beclin 1基因的RNA干扰质粒pSUPER—Beclin 1转染HeLa细胞后，Beclin 1、caspase-9 mRNA和蛋白的表达明显降低(P＜0.05)，与未转染组相比，G1期细胞比例明显减少，S期细胞比例明显增高，凋亡细胞和自噬细胞明显减少，自噬泡形成减少，细胞生长活性增强；6．表达质粒pcDNA3.1(+)—Beclin 1使HeLa细胞裸鼠体内Beclin 1蛋白表达增加，成瘤时间延长，细胞生长减慢，瘤体体积及重量明显变小，抑瘤率为52.15％；RNA干扰质粒pSUPER-Beclin 1则抑制Beclinl蛋白表达，缩短成瘤时间，肿瘤体积和重量增大达40.32％。结论自噬基因Beclin 1与宫颈癌的发生、发展有关，自噬基因Beclin 1可有效调控肿瘤细胞周期，抑制宫颈癌细胞的恶性增殖，提高肿瘤细胞的自噬和凋亡能力，部分逆转其恶性表型，同时提高细胞的自噬和凋亡能力可能成为宫颈癌基因治疗的新靶点。