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背景原发性肝癌是世界常见的恶性肿瘤之一,全球约半数的肝癌患者集中在中国。目前临床肝癌诊疗中还存在着早期诊断困难、复发转移率高,预后差等特点,其死亡率在我国恶性肿瘤中居第二位。在肝癌的综合治疗中,化疗是重要方法之一,而肝癌的多药耐药已成为制约化疗效果及影响患者生存的主要难点。Nucleophosmin (NPM)是一核仁磷酸化蛋白,它参与RNA合成与装配、染色体复制,调节抑癌基因p53和p14的活性,作为分子伴侣防止蛋白集聚,在细胞增殖和生长中发挥重要作用。现有研究报道,NPM可能是胃癌、结肠癌、卵巢癌和前列腺癌的肿瘤标记物之一,而且NPM可能通过抑制依赖于干扰素调节因子(IRF-1)的抗癌监视作用参与肿瘤的发生发展。Polo-like kinase 1 (Plkl)属于有丝分裂丝氨酸／苏氨酸激酶家族,是G2／M期DNA损伤检测点重要激酶,对中心体的成熟,双极纺锤体的形成及胞浆分裂等起重要作用。Plk1作为启动细胞分裂和正性推进的酶,在细胞增殖过程中起重要作用。在多种肿瘤中,Plk1常表现为过表达并与不良预后密切相关。有研究报道,靶向Plk1的反义寡核苷酸可以增强乳腺癌细胞对多西他赛的敏感性。因此,我们设想NPM及Plk1在肝癌的多药耐药中也发挥类似作用。目的1、观察肝癌多药耐药细胞中NPM的表达,并应用其特异性抑制剂NSC348884下调其表达,明确NPM是否参与肝癌多药耐药；2、利用基因工程技术转染NPM至HepG2,建立稳定转染细胞系,探讨NPM在肝癌多药耐药中的作用；3、检测Plk1在HepG2/NPM的表达,探讨其在NPM介导肝癌多药耐药的作用。方法1、检测肝癌细胞株HepG2及耐药株HepG2/ADM中NPM的蛋白及mRNA表达量；应用NPM特异性抑制剂NSC348884,观察其对HepG2/ADM耐药性的影响：(1)CCK-8法检测NSC348884对HepG2/ADM细胞的剂量—效应曲线；(2)CCK-8法检测NSC348884预处理耐药细胞后,应用三种不同机制化疗药物(ADM,5-FU和DDP)后的细胞存活率；(3)罗丹明蓄积实验检测对细胞膜上p-gP功能的影响。2、构建稳定转染细胞系HepG2/NPM,上调NPM的表达,观察对化疗药物敏感性的影响：(1)CCK-8法检测应用三种化疗药物后转染细胞的存活率；(2)流式细胞术AnnexinV-PI法检测对5-Fu的凋亡率；(3) Caspase-3检测细胞的凋亡；(4) Western blot检测多药耐药相关基因蛋白的表达；(5) real-time PCR检测多药耐药相关基因的表达。3、检测Polo-like kinase 1在HepG2和HepG2／NPM的表达,使用Polo-like kinase 1特异性抑制剂BI2536,观察对转染细胞多药耐药性的影响,进行如下实验：(1)Polo-like kinase1蛋白及mRNA表达的检测；(2)CCK-8法检测BI2536对HepG2/NPM细胞的剂量-效应曲线；(3)CCK-8法检测BI2536预处理后应用ADM,5-Fu及DDP对HepG2/NPM存活率的影响；(4)Annexin V-PI检测经过B12536预处理后的HepG2/NPM转染细胞系对5-Fu的凋亡率；(5)Western blot检测多药耐药相关基因蛋白的表达；(6)real-time PCR检测多药耐药相关基因的表达。结果1、肝癌多药耐药细胞(HepG2/ADM)中NPM的高表达经Western blot及real-time PCR检测,发现耐药细胞HepG2/ADM与亲代细胞HepG2相比NPM蛋白和mRNA均明显上升,有统计学意义,说明这种上升发生于基因水平。给予Nucleophosmin特异性抑制剂NSC348884预处理HepG2/ADM,细胞对ADM、DDP、5-Fu三种化疗药物的敏感性增强。2、稳定转染细胞系的建立及耐药性检测采用LipofectamineTM 2000转染pEGFP/NPM至肝癌细胞HepG2, G418筛选,建系。采用real-time PCR检测稳定转染细胞NPM mRNA表达水平,Western blot检测蛋白表达,均可以发现NPM明显上调,说明稳定转染细胞系HepG2/NPM成功建立。CCK-8法结果显示,HepG2/NPM于ADM、DDP和5-Fu的敏感性均显著低于亲本细胞HepG2(p<0.05),说明NPM增强了HepG2的多药耐药性。与CCK-8法结果一致,AnnexinV-PI双标法检测发现HepG2／NPM给药后凋亡率下降,细胞呈现出对化疗药物的耐受性。与HepG2组相比,HepG2/NPM组Caspase-3相对活性显著降低。Western blot结果显示：多药耐药相关基因中MDR-1和MRP-1的蛋白表达水平较对照组明显升高,而LRP-1的表达无明显变化。real-time PCR结果显示在HepG2/NPM中MDR-1和MRP-1表达明显增高,而LRP-1的表达无明显变化,提示NPM介导的肝癌细胞多药耐药可能与MDR-1和MRP-1的表达上调有关,这种改变发生于基因水平。3、Polo-like kinase 1 (Plkl)在NPM参与肝癌MDR中的作用Plk1在HepG2/NPM较HepG2蛋白表达明显上升,而mRNA表达无差异,说明改变发生于转录后而非基因水平。经BI2536作用后,HepG2/NPM细胞对各药的敏感性增强,其IC50明显下降(P<0.05)。结果显示,BI2536处理后再给予5-Fu,细胞凋亡率上升,说明敏感性增强。Western blot结果显示：给予BI2536处理后HepG2/NPM细胞MDR-1蛋白含量显著下降,而MRP-1及LRP-1蛋白含量无明显变化。real-time PCR检测发现给药后HepG2/NPM细胞MDR-1的mRNA水平降低,提示Plk-1对MDR-1的作用发生于基因水平。结论1、NPM增强了肝癌细胞HepG2的多药耐药性；2、NPM介导的肝癌细胞多药耐药性与其抑制Caspase-3的活性和对MDR-1及MRP-1的上调有关,而与LRP-1无关；3、Plk-1参与了NPM介导的肝癌MDR,其机制可能与其对MDR-1基因表达的上调有关。