威兰胶(Welan gum)是鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.WG)在代谢过程中产生的一种胞外高分子杂多糖,因其独特的分子结构和出色的流变学特性,被广泛的应用在石油开采、食品、建筑等诸多领域。本文以威兰胶的预测合成途径为依据,构建关键酶UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(UgpG)和葡萄糖磷酸异戊二烯转移酶(WelB)过表达菌株,以确定UgpG和WelB的过表达对威兰胶的产量及结构的影响,为后续构建高产基因工程菌株提供理论依据。本论文的主要研究内容如下:首先,构建了威兰胶关键酶过表达菌株。以Sphingomonas sp.WG基因组为模板扩增ugpG和welB基因,将其分别与pBBR1MCS-3连接,构建重组质粒pBBR1MCS-3-ugpG/welB。将两个重组质粒分别转化Sphingomonas sp.WG,构建鞘氨醇单胞菌重组菌Sphingomonas sp.WG/pBBR1MCS-3-ugpG(A菌株)和Sphingomonas sp.WG/pBBR1MCS-3-welB(B菌株)。随后,将野生菌株和A、B菌株分别在LB培养基和发酵培养基中培养,并分析关键酶过表达对威兰胶合成的影响。在LB培养基中培养96 h时,A菌株的威兰胶产量及发酵液粘度比野生菌分别提高了约8.58%和42.71%;在发酵培养基中培养72 h时,其威兰胶产量及发酵液粘度分别提高了约27.75%和6.86%。在LB培养基中培养96 h时,B菌株发酵液粘度是野生菌的9.87倍;在发酵培养基中培养48 h时,其威兰胶产量提高了约21.02%。以上结果表明关键酶UgpG和WelB的过表达可以提高威兰胶的产量或发酵液的粘度。此外,本文还对分离纯化的威兰胶多糖样品进行了初步的结构鉴定。A、B菌株所产威兰胶与野生菌具有相似的官能团;同野生菌株相比,A、B菌株的总糖、糖醛酸和乙酰基含量都有所提高,表明关键酶UgpG和WelB的过表达对威兰胶的结构产生了一定影响。最后,为克服pBBR1MCS系列载体表达外源蛋白时含有多余β-半乳糖苷酶短肽的缺陷,我们以pBBR1MCS-3质粒为改造模板,构建了一个新型高效表达载体pBBRtac3。利用融合PCR技术将源于质粒pGEX4T-1的Ptac、Ter基因片段和质粒pBBR1MCS-3的多克隆位点MCS基因片段融合,获得新型表达元件PMT;利用PCR技术扩增得到pBBR1MCS-3的骨架结构pMCS3;将PMT和pMCS3进行双酶切后利用DNA连接酶进行连接,获得pBBRtac3。同时,通过Sphingomonas sp.WG中关键酶UgpG在E.coli BL21(DE3)中诱导表达为例,对该载体的有效性进行研究。结果显示,当以pBBRtac3为表达载体时,UgpG的表达量显著提高。此载体为后续进一步获得威兰胶高产菌株奠定了基础。