论文部分内容阅读
趋化因子(chemokine)是指对于炎性细胞具有趋化作用的一类小分子蛋白，根据其分子结构中4个位点上的半胱氨酸残基的分布以及附近氨基酸残基的结构分为CXC、CC、C和CX3C四种类[1]。趋化因子RANTES是趋化性细胞因子CC亚族成员（CCL5），其分子量为8KD，N端没有糖基化位点，许多细胞如NK细胞和γδT细胞[2]都可组成性表达RANTES。趋化因子RANTES通过结合细胞表面的趋化因子受体诱发致炎性免疫应答[3]。RANTES能够诱导白细胞向炎症部位浸润，是一种典型的趋化性细胞因子，也是有效的白细胞激活剂，参与很多炎症反应。在很多疾病的病理生理过程中起着重要作用，如多发性硬化、类风湿性关节炎、器官移植排斥、心脑血管疾病、肿瘤以及HIV等，为临床治疗这些疾病展示了诱人前景。然而,从天然组织中分离RANTES有限，难以满足对其生物学功能研究和临床应用的需要。因此，运用基因工程方法生产RANTES，具有一定的研究和应用价值。 本实验尝试使用具备真核细胞蛋白翻译后加工机制和较强分泌表达能力，同时又具备操作简单，遗传背景清楚，廉价等优点的低等真核表达系统——毕赤酵母表达系统来实现RANTES蛋白的分泌表达。 本研究首先利用NCBI上登录的RANTES基因序列(登录号为NM002985)为依据，设计引物，从人体血液中提取RNA，经过RT-PCR和PCR扩增出相应的RANTES基因片段。(两端加入EcoR I和Not I酶切位点)，转化大肠杆菌JM109，用菌落PCR和质粒PCR方法筛选阳性克隆；用EcoR I和Not I酶切鉴定重组质粒。得到的质粒用EcoR I和Not I酶切，切胶回收后定向插入pPIC9K质粒，重组质粒命名为pPIC9K/rantes。质粒用Sal I酶切线性化处理后，经电击转化GS115毕赤酵母，对在MDS平板上生长出的单菌落进行G418抗生素筛选，以获得高拷贝的阳性克隆，同时用MD和MM培养基，进行重组子的Mut+和Muts表型鉴定；破碎细胞，提取基因组，用PCR的方法进一步鉴定对获取的阳性克隆进行PCR验证，选择其中的Mut+型多拷贝阳性克隆进行甲醇诱导表达，并以整合上线性空载体的GS115作为对照。以甲醇诱导目的蛋白表达，产物经SDS-PAGE和Wesrtern-blot分析，得到高效表达RANTES的重组酵母，pPIC9K/rantes，SDS-PAGE和Western-blot分析证明诱导重组酵母表达了RANTES蛋白，分子量接近8KD，与预期的8~10KD的人体RANTES基因编码蛋白质构成的融合蛋白大小一致。 本研究首次在毕赤酵母真核表达体系中表达了人体趋化因子RANTES蛋白，相关研究内容丰富了趋化因子RANTES的基因和表达的研究，也为其他趋化因子的表达提供了理论参考。