G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors,GPCRs)是哺乳动物基因组中种类最多,功能最多样化的细胞表面超家族膜蛋白受体。GPCRs能够广泛感知细胞外的各种刺激,并通过激活下游特定的信号通路参与调控生物体内多种多样的生理活动,据统计GPCRs已经发展成为人体内最大的药物靶标。生物体内GPCRs种类和数目繁多,但它们介导的下游信号通路却十分的保守,所有GPCRs都是通过介导Gs、Gi/o、Gq/11、G12/13这四种类型的G蛋白行使功能的。G蛋白信号调控系统是一个十分复杂的网络系统,对G蛋白激活的研究也是GPCRs研究领域的热点和难点。目前,已经解析出了近百种GPCRs及十几种GPCR-G蛋白复合物静息状态下的晶体结构或电镜结构,但对于GPCRs激活后G蛋白动态构象变化的研究却不是很多。因此,应用蛋白质动力学分析方法探究GPCRs接受胞外信号后,如何将这一信号传递给G蛋白及G蛋白激活后构象动态变化的研究显得尤为重要。时间分辨荧光技术能够反映复杂体系中蛋白质可能存在的构象及其分布等信息,且与稳态光谱中荧光强度检测相比,时间分辨荧光光谱检测到的荧光寿命等信息,不受光强、光路散射、探针浓度等影响,是荧光探针的固有属性,因此,是研究体系中蛋白质构象及其变化很好的方法。本文第一部分实验,我们发展应用了时间分辨荧光技术,并结合荧光非天然氨基酸7-HC良好的荧光特性和位点特异性标记的优势,探究了 Gαi1蛋白在激活过程中不同位点构象状态的变化。通过对G蛋白不同位点激活过程中的荧光寿命及各向异性的测定,结合晶体结构对G蛋白激活的分子基础进行分析。第二部分实验我们同样应用了时间分辨荧光技术,并发展了基于荧光寿命的FRET分析方法,对Gαs和Gαi蛋白的构象分布状态,及这两种G蛋白在响应β2AR激活过程中可能存在的构象差异进行分析。打破了目前对β2AR-G蛋白复合物结构研究仅限于β2AR-Gs蛋白复合物研究的现状,提出了 β2AR对Gαs/Gαi蛋白具有不同的激活效应,并对生物体内β2AR对Gαs的优先激活作用进行了说明。同时,在第三部分实验中我们运用了冷冻电镜技术解析出长效激动性配体Formetrol激活状态下β2AR-Gs复合物的电镜结构,并结合cAMP功能实验分析,对配体不同激活效应的结构基础进行分析。调研发现,目前不同配体结合产生的药效差异性主要归因于配体诱导GPCRs构象变化的差异,且已有相关实验数据将配体-受体的结合和下游G蛋白的核苷酸交换过程偶联起来。我们选择了 β2AR的特异性长效激动配体Formetrol,并通过对比BI167107-β2AR-Gs复合物结构的差异,从下游G蛋白激活角度将GPCRs构象差异与功能差异间建立起联系。同时,我们还简单的对tfmF特异性标记和19F-NMR检测方法进行了介绍,比较了纯化条件下和近似原位条件下模式蛋白MEKK3-MEK5间相互作用前后化学位移和弛豫的变化,同时我们也在积极尝试将这一方法应用于GPCRs-G蛋白相互作用的研究中。为后续探究GPCR-G蛋白相互作用奠定了技术基础。