【摘 要】
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BIBAC载体设计的具有许多优于YAC和PAC的方面。它不会出现重组交换而导致的基因嵌合现象,可以在大肠杆菌和农杆菌中进行穿梭;在农杆菌介导下能直接将外源基因整合到植物基因
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BIBAC载体设计的具有许多优于YAC和PAC的方面。它不会出现重组交换而导致的基因嵌合现象,可以在大肠杆菌和农杆菌中进行穿梭;在农杆菌介导下能直接将外源基因整合到植物基因组中,一旦获得目标阳性克隆后,不需要进行亚克隆就可以直接转化植物,进行功能互补实验;验证功能后含有目的基因的克隆,即使基因结构未知,也可直接进行植物转基因育种工作,加速分子育种的研究进程。 东乡野生稻(2n=24)是世界纬度最北(位于东经116°36′,北纬28°14′)的普通野生稻,它在-12.8～0℃低温条件下仍能安全越冬,具宿根(多年生),再生力和繁殖(无性)力强,耐旱、耐贫瘠及多种抗逆性等各种有利性状及含胞质不育基因、广亲和基因、恢复基因、抗病虫基因等多种有利基因。 本研究在参考了前人BIBAC、TAC和BAC文库构建方法的基础上,通过改进建立了一套可转化大片段文库构建技术体系。包括载体的制备、高分子量DNA的提取、酶切条件的确定、片段大小的选择、目的大片段的回收、连接及转化体系,最终获得了所需大小的插入片段,重组率高的BIBAC文库构建体系。 利用所建立的BIBAC文库构建体系,以BIBAC2为载体,构建了东乡野生稻BIBAC2文库,选择野生稻幼嫩叶片,提取高分子量DNA,选择合适的酶量,选取50-100 kb左右范围的片段。到目前为止共获得了14 592个重组克隆,通过随机挑取26个克隆采用碱裂解法提取质粒,琼脂糖脉冲电泳结果表明空载率为7.8%,克隆重组率为92.2%平均插入片段为65 kb,覆盖东乡野生稻基因组2倍。对文库进行了稳定性测试,结果表明东乡野生稻基因组能够稳定的在BIBAC2中稳定存在。接种了四种水稻的成熟胚,在NB培
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