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创伤修复分为3个阶段：炎症反应期、组织形成期和重塑期，皮肤创面修复涉及多种细胞活动，包括炎症细胞的浸润和凋亡，皮肤细胞的上皮-间质转化(epithelial-mesenchymaltransition，EMT)，胶原、各种细胞因子和细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)的生成等。而上述细胞活动出现紊乱将会引起皮肤病理性创伤修复，导致各种并发症，如皮肤瘢痕的形成、皮肤纤维化、伤口延迟愈合或不完全愈合，给患者生理和心理带来许多不良影响，严重时甚至可威胁患者生命。目前，临床上瘢痕、皮肤纤维化[1]、面积较大或较深皮肤缺损的修复方法的治疗效果仍不能让人满意。HDAC6抑制剂Tubacin对皮肤创伤的治疗效果及其机制研究
近年来的研究发现，组蛋白去乙酰化酶抑制剂（Histonedeacetylaseinhibitor，HDACi）可能成为皮肤损伤修复的新途径。特异性Ⅰ和Ⅱ型HDACi曲古抑菌素A（TrichostatinA，TSA）能显著抑制胶原蛋白合成，进而促进创伤修复，抑制瘢痕形成[2,3]；同时TSA能抑制皮肤炎症的发展[4]，抑制人肾上皮细胞中由转化生长因子-β1（transforminggrowthfactor-β1,TGF-β1）诱导的EMT[5]。
组蛋白去乙酰化酶6（HDAC6）是HDAC的ClassⅡ家族中最独特的成员，主要定位在细胞质，参与调控细胞形态、自噬、迁移及氧化应激保护等相关功能。文献报道，HDAC6抑制剂TubastatinA可抑制博来霉素诱导的肺纤维化[6]，并通过抑制腹膜间皮细胞EMT的进程，最终抑制腹膜纤维化[7]。
但是，HDAC6在皮肤损伤修复中是否起作用仍未被研究。鉴于HDAC6在氧化应激、基质合成等过程中的作用，本文探讨HDAC6抑制剂tubacin对皮肤成纤维细胞增殖、迁移的影响及其在全层皮肤创伤修复中的作用及可能机制。
第一部分Tubacin对TGF-β1诱导的皮肤成纤维细胞的增殖、迁移的影响研究
【目的】
体外原代培养新生SD大鼠皮肤成纤维细胞，探讨HDAC6特异性抑制剂tubacin对TGF-β1诱导的大鼠皮肤成纤维细胞增殖、迁移能力的影响及其机制。
【方法】
1.体外原代培养新生SD大鼠皮肤成纤维细胞，取第4-8代细胞用于实验。
2.MTT法检测不同浓度tubacin对大鼠皮肤成纤维细胞增殖活性的影响。
3.流式细胞术测定tubacin对大鼠皮肤成纤维细胞细胞周期的影响。
4.体外划痕实验研究tubacin对大鼠皮肤成纤维细胞迁移的影响。
5.Westernblot研究各组细胞HDAC6、Ⅰ型胶原α1(CollagenTypeIAlpha1,COL1A1)、Ⅲ型胶原(CollagenTypeⅢ,COL3)、α平滑肌肌动蛋白（αsmoothmuscleactin，α-SMA）、血小板内皮细胞黏附因子（Plateletendothelialcelladhesionmolecule1，PECAM-1/CD31）、p-ERK、t-ERK和p-AKT、t-AKT蛋白表达水平变化。
6.免疫荧光检测tubacin对大鼠皮肤成纤维细胞蛋白表达及分布的影响。
【结果】
1.不同浓度tubacin处理24h后，与对照组相比，10μMtubacin组和20μMtubacin组的细胞存活率明显降低，差异有统计学意义（P＜0.01），且20μMtubacin组的作用更明显，细胞存活率降低至60％；不同浓度tubacin预处理细胞6h后加入10ng/mLTGF-β1共处理24h，与对照组比较，仅用10ng/mLTGF-β1处理24h后，细胞存活率没有明显变化；不同浓度tubacin预处理6h后的细胞存活率降低，差异有统计学意义（P＜0.01），随着tubacin浓度的增加，细胞存活率逐渐降低。
2.各组处于G0/G1期、S期和G2/M期的细胞比例没有明显差异。
3.TGF-β1单独作用24h后，与对照组相比，24h与0h划痕面积的比值无明显差异；不同浓度tubacin预处理细胞6h后加入10ng/mLTGF-β1共处理24h，与对照组比较，24h与0h划痕面积的比值明显大于对照组的比值，差异有统计学意义（P＜0.01）。
4.与对照组对比，TGF-β1处理组的COL3和p-AKT表达上调，Tubacin预处理后下调HDAC6、COL1A1、a-SMA和p-ERK的表达，同时显著增加Ace-α-tubulin与CD31的表达。与TGF-β1组对比，Tubacin预处理组的HDAC6、COL1A1、COL3、α-SMA、p-ERK和p-AKT表达均下调，而Ace-α-tubulin表达上调。
5.Tubacin对HDAC6和α-SMA表达及分布无明显影响；tubacin能促进Ace-α-tubulin的表达，同时抑制COL1A1的表达。
第二部分Tubacin对皮肤伤口修复的影响研究
【目的】
构建大鼠全层创伤动物模型，研究tubacin对皮肤创伤修复的影响及其机制。
【方法】
1.观察并记录tubacin对大鼠皮肤创伤愈合的影响，计算创伤愈合率。
2.皮肤组织切片进行HE染色和Masson染色，从组织层面观察tubacin对皮肤创伤的组织修复及基质重建的影响。
3.Westernblot研究各组皮肤组织中COL3、COLA1和α-SMA蛋白表达水平变化。
【结果】
1.对照组和tubacin组创伤后第7、14、21、28天伤口愈合率均无明显差异。HE染色显示，tubacin组皮肤附属器比对照组发育地更成熟，且再生上皮厚度也小于对照组，差异有统计学意义（p＜0.01）。Massion染色结果显示，tubacin组的胶原纤维沉积比对照组少，伤口愈合过程中的基质沉积更少。
2.创伤后第7、14、21天皮肤中HDAC6的表达水平明显上调，差异有统计学意义（p＜0.05）；与创伤后第14、21天比较，创伤后第28天皮肤中HDAC6的表达水平明显下调，差异有统计学意义（p＜0.01）。创伤后第7天皮肤中Ace-α-tubulin的表达水平明显上调，差异有统计学意义（p＜0.01）。
3.与对照组第1天对比，对照组第14天COL3的表达水平上调；与对照组第14天比较，tubacin组第14天COL3表达水平明显降低。对照组第7天和第14天的COL1A1表达水平上调，且对照组第14天上调的水平比第7天的高；与相对应的对照组相比，tubacin组第7天和第14天的COL1A1的蛋白表达水平均明显下调。第7天tubacin组的α-SMA表达水平上调。与创伤后第1天比较，第7天对照组的HDAC6和Ace-α-tubulin的表达均明显上调，而第7天tubacin组与对照组比较，HDAC6和Ace-α-tubulin的表达明显降低。
【结论】
1.HDAC6抑制剂Tubacin能抑制TGF-β1的皮肤成纤维细胞的增殖、迁移，并下调与创伤修复相关的COL1A1、COL3、α-SMA蛋白表达，可能与下调p-ERK和p-AKT通路有关。
2.Tubacin对伤口愈合速度无明显作用，但是Tubacin促进伤口再生上皮转化为正常成熟上皮，促进皮肤伤口功能性愈合。
3.全层创伤皮肤组织中HDAC6、Ace-α-tubulin、COL3和COL1A1蛋白表达水平上调。tubacin能够明显抑制以上蛋白的表达，且tubacin在创伤早期使α-SMA的表达水平上调。
近年来的研究发现，组蛋白去乙酰化酶抑制剂（Histonedeacetylaseinhibitor，HDACi）可能成为皮肤损伤修复的新途径。特异性Ⅰ和Ⅱ型HDACi曲古抑菌素A（TrichostatinA，TSA）能显著抑制胶原蛋白合成，进而促进创伤修复，抑制瘢痕形成[2,3]；同时TSA能抑制皮肤炎症的发展[4]，抑制人肾上皮细胞中由转化生长因子-β1（transforminggrowthfactor-β1,TGF-β1）诱导的EMT[5]。
组蛋白去乙酰化酶6（HDAC6）是HDAC的ClassⅡ家族中最独特的成员，主要定位在细胞质，参与调控细胞形态、自噬、迁移及氧化应激保护等相关功能。文献报道，HDAC6抑制剂TubastatinA可抑制博来霉素诱导的肺纤维化[6]，并通过抑制腹膜间皮细胞EMT的进程，最终抑制腹膜纤维化[7]。
但是，HDAC6在皮肤损伤修复中是否起作用仍未被研究。鉴于HDAC6在氧化应激、基质合成等过程中的作用，本文探讨HDAC6抑制剂tubacin对皮肤成纤维细胞增殖、迁移的影响及其在全层皮肤创伤修复中的作用及可能机制。
第一部分Tubacin对TGF-β1诱导的皮肤成纤维细胞的增殖、迁移的影响研究
【目的】
体外原代培养新生SD大鼠皮肤成纤维细胞，探讨HDAC6特异性抑制剂tubacin对TGF-β1诱导的大鼠皮肤成纤维细胞增殖、迁移能力的影响及其机制。
【方法】
1.体外原代培养新生SD大鼠皮肤成纤维细胞，取第4-8代细胞用于实验。
2.MTT法检测不同浓度tubacin对大鼠皮肤成纤维细胞增殖活性的影响。
3.流式细胞术测定tubacin对大鼠皮肤成纤维细胞细胞周期的影响。
4.体外划痕实验研究tubacin对大鼠皮肤成纤维细胞迁移的影响。
5.Westernblot研究各组细胞HDAC6、Ⅰ型胶原α1(CollagenTypeIAlpha1,COL1A1)、Ⅲ型胶原(CollagenTypeⅢ,COL3)、α平滑肌肌动蛋白（αsmoothmuscleactin，α-SMA）、血小板内皮细胞黏附因子（Plateletendothelialcelladhesionmolecule1，PECAM-1/CD31）、p-ERK、t-ERK和p-AKT、t-AKT蛋白表达水平变化。
6.免疫荧光检测tubacin对大鼠皮肤成纤维细胞蛋白表达及分布的影响。
【结果】
1.不同浓度tubacin处理24h后，与对照组相比，10μMtubacin组和20μMtubacin组的细胞存活率明显降低，差异有统计学意义（P＜0.01），且20μMtubacin组的作用更明显，细胞存活率降低至60％；不同浓度tubacin预处理细胞6h后加入10ng/mLTGF-β1共处理24h，与对照组比较，仅用10ng/mLTGF-β1处理24h后，细胞存活率没有明显变化；不同浓度tubacin预处理6h后的细胞存活率降低，差异有统计学意义（P＜0.01），随着tubacin浓度的增加，细胞存活率逐渐降低。
2.各组处于G0/G1期、S期和G2/M期的细胞比例没有明显差异。
3.TGF-β1单独作用24h后，与对照组相比，24h与0h划痕面积的比值无明显差异；不同浓度tubacin预处理细胞6h后加入10ng/mLTGF-β1共处理24h，与对照组比较，24h与0h划痕面积的比值明显大于对照组的比值，差异有统计学意义（P＜0.01）。
4.与对照组对比，TGF-β1处理组的COL3和p-AKT表达上调，Tubacin预处理后下调HDAC6、COL1A1、a-SMA和p-ERK的表达，同时显著增加Ace-α-tubulin与CD31的表达。与TGF-β1组对比，Tubacin预处理组的HDAC6、COL1A1、COL3、α-SMA、p-ERK和p-AKT表达均下调，而Ace-α-tubulin表达上调。
5.Tubacin对HDAC6和α-SMA表达及分布无明显影响；tubacin能促进Ace-α-tubulin的表达，同时抑制COL1A1的表达。
第二部分Tubacin对皮肤伤口修复的影响研究
【目的】
构建大鼠全层创伤动物模型，研究tubacin对皮肤创伤修复的影响及其机制。
【方法】
1.观察并记录tubacin对大鼠皮肤创伤愈合的影响，计算创伤愈合率。
2.皮肤组织切片进行HE染色和Masson染色，从组织层面观察tubacin对皮肤创伤的组织修复及基质重建的影响。
3.Westernblot研究各组皮肤组织中COL3、COLA1和α-SMA蛋白表达水平变化。
【结果】
1.对照组和tubacin组创伤后第7、14、21、28天伤口愈合率均无明显差异。HE染色显示，tubacin组皮肤附属器比对照组发育地更成熟，且再生上皮厚度也小于对照组，差异有统计学意义（p＜0.01）。Massion染色结果显示，tubacin组的胶原纤维沉积比对照组少，伤口愈合过程中的基质沉积更少。
2.创伤后第7、14、21天皮肤中HDAC6的表达水平明显上调，差异有统计学意义（p＜0.05）；与创伤后第14、21天比较，创伤后第28天皮肤中HDAC6的表达水平明显下调，差异有统计学意义（p＜0.01）。创伤后第7天皮肤中Ace-α-tubulin的表达水平明显上调，差异有统计学意义（p＜0.01）。
3.与对照组第1天对比，对照组第14天COL3的表达水平上调；与对照组第14天比较，tubacin组第14天COL3表达水平明显降低。对照组第7天和第14天的COL1A1表达水平上调，且对照组第14天上调的水平比第7天的高；与相对应的对照组相比，tubacin组第7天和第14天的COL1A1的蛋白表达水平均明显下调。第7天tubacin组的α-SMA表达水平上调。与创伤后第1天比较，第7天对照组的HDAC6和Ace-α-tubulin的表达均明显上调，而第7天tubacin组与对照组比较，HDAC6和Ace-α-tubulin的表达明显降低。
【结论】
1.HDAC6抑制剂Tubacin能抑制TGF-β1的皮肤成纤维细胞的增殖、迁移，并下调与创伤修复相关的COL1A1、COL3、α-SMA蛋白表达，可能与下调p-ERK和p-AKT通路有关。
2.Tubacin对伤口愈合速度无明显作用，但是Tubacin促进伤口再生上皮转化为正常成熟上皮，促进皮肤伤口功能性愈合。
3.全层创伤皮肤组织中HDAC6、Ace-α-tubulin、COL3和COL1A1蛋白表达水平上调。tubacin能够明显抑制以上蛋白的表达，且tubacin在创伤早期使α-SMA的表达水平上调。