功能核酸荧光探针及信号放大策略检测L-组氨酸及Hg2+、Cu2+方法研究

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功能核酸是一种特异性结合靶向分子或靶向分子作为辅酶的核酸分子,因其高效识别性能,在环境、生物分析、药物检测以及食品安全检测等领域有着广阔的应用前景。杂交链式反应是一种新型的体外核酸恒温扩增技术,其实验原理是基于两个自身稳定的核酸发夹探针只有在引物DNA存在时才能开始杂交形成长双链,由于它是有引发链引起的反应,可以有效的减少假阳信号,降低背景信号。随着目标物质检测水平的不断提高,对生物传感的检测手段要求越来越高。因此,开发高灵敏。高特异性的传感方法用于目标物的定量或定向检测受到了很多研究者们的青睐。针对以上考虑,本文借助功能核酸,结合杂交链式信号扩增反应和以DNA为支架构建的荧光探针等技术,以L-组氨酸与金属离子为研究对象,开展了以下工作:第二章构建了一种新型的基于杂交链式反应(HCR)的DNA核酶传感分析检测L-组氨酸。DNA核酶作分子识别元件,HCR反应作信号放大方法,G-quadruplex作报告基团。L-组氨酸不存在时,DNA核酶结构稳定,HCR反应的引物被锁入DNA核酶中,不能发生HCR反应,荧光信号极弱。L-组氨酸存在时,DNA核酶特异性切割底物释放出HCR反应的引物,打开两个发夹探针,释放出G-quadruplex,结合锌卟啉后引起该传感体系的荧光增强。实验结果表明,体系的荧光强度与L-组氨酸浓度的对数值成正比,对L-组氨酸检测的线性范围为 1.5×10-9mol L-1-5.0×10-6 mol·L-1,检测限达2.433×10-9 mol·L-1,对实际样品中检测的回收率达到96.98%~103.3%。与传统方法相比,该方法具有无需标记、检出限低及选择性好等优点,可用于临床实验的测定。第三章构建了一种基于T-Hg2+-T结构简单灵敏检测Hg2+的荧光生物传感器。富含碱基胸腺嘧啶(T)的核酸单链作识别分子,SYBRGreenⅠ(SG)荧光染料作报告基团。碱基T与Hg2+能特异结合形成类似双链的T-Hg2+-T结构,加入荧光染料SG后,导致传感体系荧光增强。实验结果表明,体系荧光强度与Hg2+浓度成正比,对Hg2+检测的线性范围为4.00O×10-8~1.0×10-5 mol·L-1,检测限达3.924×10-8mol·L-1,对实际水样中获得的回收率为98.72%~102.8%,该方法具有简单、灵敏以及免标记等特点,因此该传感体系可用于实际湘江水样中Hg2+的检测。第四章构建了一种基于双链DNA和荧光染料SG的荧光传感分析方法检测Cu2+。双链DNA作识别分子,SYBRGreenⅠ(SG)荧光染料作报告基团。SG嵌入到双链DNA中,使荧光增强。由于重金属离子存在荧光淬灭的特性,加入Cu2+后,Cu2+淬灭了嵌入双链DNA中SG的荧光。实验结果表明,体系荧光强度与Cu2+浓度成正比,对Cu2+检测的线性范围为4.00O×10-8~4.0×10-5mol·L-1,检测限达1.235×10-9mol·L-1,该方法在实际样品中获得的回收率为98.83%~103.8%,因此方法具有简单、灵敏以及免标记等特点,因此该传感器可用于实际水样中Cu2+的测量。
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