论文部分内容阅读
目的:ASIC1a（acid-sensitive ion channel 1a）是酸敏感离子通道家族成员,在外周和中枢神经系统中广泛表达,此外还发现在小鼠树突状细胞（DC）、巨噬细胞、肺动脉平滑肌细胞以及软骨细胞等均有表达,因其与多种疾病的发生与发展密切相关而具有重要生理学意义。巨噬细胞（macrophage）是天然免疫的重要组成部分,激活状态下分为M1型和M2型,在机体中对清除病原体、炎症及组织修复相关的初级免疫应答发挥重要作用。本课题组前期研究发现,巨噬细胞表达功能性ASIC1,ASIC1a敲除可上调M1型巨噬细胞膜分子CD80、CD86的表达,提示ASIC1a可能存在抑制M1型巨噬细胞的抗原提呈作用;ASIC1a在M2型巨噬细胞极化过程作用如何,并未有研究。本课题旨在研究ASIC1a在小鼠M2型骨髓来源巨噬细胞（bone marrow derived macrophage,BMM）和M2型腹腔巨噬细胞（peritoneal macrophage,PM）极化过程中是否发挥作用,并进一步探讨ASIC1a影响M2型极化过程的机制。研究方法:取野生型（WT,Wild Type）与ASIC1a-/-小鼠诱导培养BMM与PM,流式细胞术检测F4-80标记阳性巨噬细胞进行鉴定。IL-4刺激24h分别诱导M2型BMM与PM,RT-PCR检测M2型巨噬细胞标记物Arg1、FIZZ1、YM1、Mgl1和Mgl2 mRNA表达水平,免疫印记法（WB）检测M2型巨噬细胞标记蛋白Arg1及巨噬细胞ASIC1蛋白表达,流式细胞术检测M2型巨噬细胞表面分子CD206与胞内分子FIZZ1表达。IL-4刺激BMM与PM不同时间点30min、60min、180min后,WB检测M2型巨噬细胞极化过程信号通路中STAT6磷酸化蛋白水平。实验所得数据用平均值±标准差表示,采用统计学软件GraphPad Prism 6进行双因素方差分析（Two way ANOVA）,两两比较采用student’s t检验,P﹤0.05时具有统计学意义。结果:流式细胞术检测BMM与PM细胞中F4-80标记的阳性巨噬细胞率分别约为96.6%和91.1%。一、IL-4刺激来源于WT与ASIC1a-/-小鼠的BMM后:与WT相比,RT-PCR检测ASIC1a-/-的M2型BMM标记物Arg1、FIZZ1、YM1、Mgl1和Mgl2 mRNA表达均出现不同程度的降低,WB检测Arg1蛋白表达明显下调;流式检测发现ASIC1a-/-的M2型BMM表面分子CD206及胞内分子FIZZ1表达均明显下调。IL-4刺激WT与ASIC1a-/-BMM不同时间点30min、60min、180min后,WB检测两组p-STAT6、STAT6表达水平之间无差异。二、IL-4刺激来源于WT与ASIC1a-/-小鼠的组织巨噬细胞PM后:与WT相比,RT-PCR检测ASIC1a-/-的M2型PM标记物Arg1、FIZZ1、YM1、Mgl1和Mgl2的mRNA表达也出现不同程度降低,WB检测Arg1蛋白表达下调;流式检测发现ASIC1a-/-M2型PM表面分子CD206及胞内分子FIZZ1表达也均明显下调。IL-4刺激WT与ASIC1a-/-的PM不同时间点30min、60min、180min后,WB检测p-STAT6、STAT6蛋白水平两组之间也无明显差异。结论:ASIC1a敲除引起M2型BMM与PM极化的下调,且此作用并非通过影响IL-4信号通路中的STAT6磷酸化下调M2型巨噬细胞的极化。