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外源基因随机整合带来的位置效应以及转基因效率低下是目前制约转基因动物发展的主要瓶颈问题,本文拟利用重组酶介导的盒式交换反应和LE/RE突变策略来解决上述问题,最终验证了这两种方法在山羊中定点整合目的基因的可行性,初步建立了基于Cre/loxp重组酶系统的定点整合转基因山羊制备的技术体系。首先分离了人溶菌酶高表达转基因山羊胎儿成纤维细胞BLG3,其基因组内包括由框架loxpI-Neo-Tk-loxp构成的盒式交换系统；构建了框架为loxp2-polyA-sCT-pblg-Puro-loxp的鲑鱼降钙素乳腺特异表达载体(pTM-sCT2).上述loxpl和loxp2均为loxp的突变体。通过转染将该载体导入到BLG3中,并经Cre酶处理,最后经PCR及测序鉴定,目的基因sCT成功整合到预定位点。通过两种方法将Cre酶引入BLG3实现定点整合。一是将真核表达载体pBS185和pTM-sCT2共转染(通过脂质体法)BLG3,根据DNA和脂质体的量不同,摸索了6种转染条件,定点整合效率最高可达40%(2/5)。二是利用TAT-Cre酶介导目的基因实现定点整合：利用电穿孔法获得的整合效率为11.1%(2/18)；利用脂质体转染法,根据脂质体和质粒DNA的量不同,摸索了6种转染条件,得到的效率最高为20%。综合比较以上两种Cre酶导入方法的利弊,确定定点整合细胞的制备流程为：构建定点整合质粒→转染BLG3,TAT-Cre处理3h→标记筛选获得抗性克隆→提取细胞DNA→目的基因整合检测及3’5’定点整合检测→扩大培养与冻存。其次,为了验证不同插入片段大小对定点整合效率的影响,本实验将pTM-sCT2中的0.2kb的sCT基因更换为4.0kb的hSAnn mini基因,构建了hSA定点整合载体,利用TAT-Cre介导该质粒实现hSA基因的定点整合,其整合效率为20%(5/25)。最后,将上述细胞系进行核移植实验,证实了经定点整合处理的阳性细胞,其克隆胚胎的融合率和桑椹囊胚发育率均与正常体细胞克隆工作的效率一致。由上可见,本研究得到了鲑鱼降钙素定点整合细胞系和人血清白蛋白定点整合细胞系。建立了一种基于Cre/loxp系统,可以实现高效转基因定点整合的转基因家畜制备方法。