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十字花科黑腐病菌Xcc8004(Xanthomonascampestrispv.Campestris8004,Xcc8004)菌株,能侵染所有十字花科植物,引起黑腐病。该菌是农作物重要的病原菌,也是研究植物病原细菌与植物相互作用机理的模式细菌之一。Xcc8004通过Ⅲ型分泌系统(TypeⅢSecretionSystem,T3SS)将效应物(T3SSeffector,T3SE)蛋白直接转运到植物细胞内,在病原菌和寄主的相互作用中发挥重要的作用。T3SE在敏感植物寄主中,通过干扰寄主的免疫系统帮助病原菌繁殖；在抗性寄主中,有些效应物能激活特定的宿主抗性基因(Rgene),引起过敏反应(hypersensitiveresponse,HR)。鉴定病原细菌的Ⅲ型效应物在寄主细胞内的功能,对阐明病原菌的致病机理、发展新的高效的防治病害的药物和方法具有重要意义。本研究的xopXccN基因,ORF号XC0241,全长2160bp,编码719个氨基酸。该基因被鉴定为T3SE,并且Tn5gusA5插入突变体050D08影响菌株的致病性(Jiang,Heetal.2008),它在寄主内的作用靶标和机制仍不清楚。
为了鉴定XopXccN的十字花科植物潜在靶标,我们通过不同的接种方法用农杆菌介导的瞬时表达筛选到了一个xopXccN(XC0241)在叶肉引起过敏反应的品种:中华水萝卜501。随后我们检测了突变体在该品种上的致病性和叶内生长情况,发现突变体影响Xcc8004在中华水萝卜501上的致病性及叶肉内生长情况。通过扫描电镜的方法观察到突变体050D08在中华水萝卜501的叶肉生长数量确实比野生型和互补株少,说明XopXccN在叶肉是一个致病因子。GUs组织染色实验表明xopXccN(XC0241)在叶肉表达随接种时间越长,表达越低,在维管束表达反之。以上结果表明xopXccN(XC0241)是一个在叶肉和维管束致病都很重要的致病因子。
Kim等通过酵母双杂交的方法报道了辣椒斑点病致病变种(Xanthomonascampestrispv.Vesicatoria,Xcv)中的同源蛋白XopN和植物里面多个蛋白互作,且该效应物抑制寄主的胼胝质沉淀(Kimetal.,2009)。我们通过农杆菌介导的瞬时表达在中华水萝卜501和番茄叶片上检测了它们的表型,结果表明XopXccN在中华水萝卜501和番茄叶片上都有过敏反应,而XopN只在番茄叶片上有过敏反应,结果表明XopXccN和XopN有不同的植物靶标和致病机理。胼胝质染色结果表明,XopXccN能抑制寄主的胼胝质沉淀。亚细胞定位结果表明XopXccN定位在植物细胞膜上。
我们用双向电泳的方法分析了野生型Xcc8004和突变体050D08侵染后的中华水萝卜501叶片的总蛋白,结果我们找到突变体050D08侵染后表达上调的5个差异蛋白点:光系统Ⅰ光捕获复合体组成蛋白(上调3.27倍)；光系统Ⅱ反应中心PsbP家族蛋白(上调3.19倍)；1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶大亚基(上调1.82倍)；液泡转化酶(上调1.85倍)；核糖体蛋白S1(上调1.86倍)。结果说明Xcc8004利用XopXccN通过干扰寄主的胼胝质沉积、干扰寄主的光反应系统,影响细胞间ROS,进而影响过敏反应达到干扰寄主的防御反应的目的。
为了在模式植物拟南芥上研究各蛋白的互作,我们首先检测了在拟南芥哥伦比亚野生型Col-O上的致病性,发现突变体的致病性降低。随后用RT-PCR检测了抗病相关基因的表达,发现Xcc8004诱导抗性基因PR1,PR2的表达,不诱导PR5的表达。
最后我们用酵母双杂交的方法来验证XopXccN是否与以上5个蛋白点直接互作,目前完成了对光系统Ⅰ光捕获复合体组成蛋白和1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶大亚基2个蛋白的杂交分析,结果表明XopXccN并不能与这2个蛋白直接互作。