肿瘤性疾病严重威胁人类的生命健康，然而目前手术、化疗、放疗等临床治疗中所采用的传统常规肿瘤治疗方法均无法实现对体内肿瘤细胞完全彻底的杀灭，使得恶性肿瘤不可避免的出现复发或转移，而且由于常规化疗药物及放疗均无法实现针对肿瘤细胞的特异性杀伤，所以在治疗杀伤肿瘤细胞的同时也使得正常组织细胞受到损伤，甚至影响机体免疫系统，存在较为严重的不良反应，使得实际临床治疗过程中部分肿瘤患者因不良反应严重无法耐受而被迫放弃治疗，所以探寻新的肿瘤特异性的治疗手段成肿瘤治疗领域的研究热点。随着生物科学的进步，为医学基础和临床研究提供了新的思路和途径，生物治疗的概念逐渐引入到人类多种重大疾病的治疗过程中。肿瘤生物免疫治疗采用过继性细胞回输作为其主要治疗方法是目前恶性肿瘤治疗领域公认的新成就之一。是指在体外对免疫细胞进行激活、扩增，而后再将活化的免疫细胞重新回输到肿瘤患者体内，进行肿瘤杀伤的一种治疗方法。目前在临床中主要是提取患者外周血中的T细胞以及树突状细胞在体外条件下分别应用各种细胞因子进行诱导刺激，活化成熟后共同培养，从而产生具有肿瘤特异性的细胞毒T淋巴细胞，而后再分次对经过放疗或化疗预处理的患者进行过继性回输，在患者体内产生具有靶向性的抗肿瘤细胞的细胞免疫杀伤疗效。同时随着相关研究的逐步增多，如何实现T细胞高效、快速的体外筛选、扩增，如何使T细胞能够高度特异性地靶向识别肿瘤靶点，如何使T细胞在体内存活时间尽可能延长以及如何能够有效调控T细胞在体内的增殖情况等均成为这一领域的研究热点。同时由于肿瘤微环境中存在复杂的免疫抑制网络，是困扰肿瘤免疫治疗的关键，使得肿瘤免疫治疗的实际效果受到了限制，总体疗效并不令人满意。早在1979年Lord等人就正式提出了肿瘤微环境的概念，肿瘤微环境即指在肿瘤发生、发展过程中所处的宿主机体的内在环境，由肿瘤细胞自身、间质细胞、微血管、微淋巴管、局部浸润性细胞、各种细胞因子以及组织液等共同构成。存在于肿瘤微环境中的各种免疫抑制性细胞及抑制性细胞因子造就了肿瘤病变局部的免疫抑制性微环境，在肿瘤的发生发展、转移侵袭等方面发挥着重要作用。所以通过特定手段对肿瘤患者体内肿瘤微环境进行干预可以提高过继性免疫治疗的疗效，应用全身化疗干扰肿瘤微环境是目前临床上最常用的方法之一。　　T细胞包括初始T细胞(naive T细胞)和记忆性T细胞(memoryT细胞)两个重要功能亚群。初始T细胞(naive T cells)是指脱离胸腺组织后还未受到过抗原刺激的T细胞，是T细胞的重要功能亚群，对于机体针对新抗原产生免疫应答非常重要，在机体内通过在血液与次级淋巴器官间的再循环执行着免疫监视功能，受到抗原刺激的时候，树突状细胞(DC)摄取抗原物质加工后在淋巴结中递呈给初始T细胞，初始T细胞能发生活化及增殖，分化成为具有靶向杀伤能力的效应性T细胞来发挥作用，当初始T细胞经细胞分化成为效应性T细胞后，其功能以及游走性质均发生变化，且活化的效应性T细胞具有极强的增殖活性，几天内可以扩增达1000倍以上。随着研究的不断深入，其在过继性免疫治疗中的应用价值逐渐得到了人们的重视。所以本研究设计了第一部分实验，应用B16肿瘤细胞接种于C57BL/6小鼠造模，通过流式细胞分析技术检测不同荷瘤时长的小鼠外周血初始T淋巴细胞数量水平的动态变化情况，了解初始T细胞水平与小鼠荷瘤后机体免疫状态的关系，为制定个体化免疫治疗方案完善相关数据。并进一步设计第二部分体外实验，应用磁珠阴性分选的方法分离提取C57BL/6小鼠脾细胞悬液中的初始T细胞及总T细胞，在体外条件下了解初始T细胞的功能特性。最终在应用环磷酰胺干扰小鼠肿瘤微环境的基础上进行第三部分实验，对荷瘤的C57BL/6小鼠分别给予初始T细胞来源的效应细胞(TEFFN)及总T细胞来源的效应细胞(TEFFP)回输治疗，进一步对比观察在复杂的体内环境中初始T细胞来源的效应细胞的疗效。　　第一部分、不同荷瘤时长的小鼠外周血初始T淋巴细胞水平变化情况的研究　　目的:通过流式细胞分析技术检测不同荷瘤时长的小鼠外周血初始T淋巴细胞数量水平的动态变化情况，了解初始T细胞水平与小鼠荷瘤后机体免疫状态的关系，为制定个体化免疫治疗方案完善相关数据。　　方法:应用C57BL/6小鼠通过背部皮下接种B16肿瘤细胞株制备恶性黑色素瘤的小鼠荷瘤模型;造模成功后定期处死小鼠取脾制备脾淋巴细胞悬液，应用流式细胞分析技术检测其中初始T淋巴细胞的数量水平，并设定正常不荷瘤小鼠为空白对照组。　　结果:　　1.将B16黑色素瘤细胞株接种于C57BL/6小鼠背部皮下，10天后局部可见直径约2-3mm的肿瘤略突出于皮面，颜色呈黑色，提示小鼠荷瘤模型成功建立。　　2.荷瘤组及对照组小鼠随周龄的增加及荷瘤时间的延长其外周血中初始T细胞水平均会出现下降表现，但荷瘤组下降幅度更为显著(P＜0.05)。　　结论:随着小鼠荷瘤时间延长荷瘤负担的增加，其外周血初始T细胞含量出现进行性下降，提示初始T细胞水平与小鼠荷瘤后机体免疫状态有着密切的关系。　　第二部分、初始T细胞的分离提取及体外功能检测　　目的:了解初始T细胞在体外环境中的功能特性。　　方法:应用磁珠阴性分选方法由小鼠脾淋巴细胞悬液中分选得出总T细胞，并流式细胞学检测了解总T细胞中初始CD8+T细胞及初始CD4+T细胞的比例，由小鼠脾淋巴细胞悬液中分选得出初始CD8+T细胞和初始CD4+T细胞依照比例混合得到初始T细胞，检测对比体外条件下，初始T细胞及总T细胞的增殖活性、细胞因子分泌能力以及不同细胞来源的效应细胞对B16细胞的杀伤能力。　　结果:　　1.经磁珠阴性分选得到富集的CD3+T、初始CD8+T及初始CD4+T细胞，流式检测鉴定其纯度，分选后CD3+T细胞纯度达90.4±1.3％、分选后初始CD8+T细胞纯度达88.6±0.5％、分选后初始CD4+T细胞纯度达82.2±0.9％，细胞纯度能够满足实施进一步实验的需要。　　2.经流式细胞学检测总CD3+T细胞中初始CD4+T细胞与初始CD8+T细胞比值为（1.9±0.1）∶1，故选择初始CD4+T细胞∶初始CD8+T细胞=2∶1的比例进行混合培养，将混合培养的初始T细胞用于后续实验。　　3.分别对总T细胞组及初始T细胞组给予两次刺激，应用CCK-8染色、酶标仪测定各实验孔OD值提示经第一次刺激后总T细胞及初始T细胞均较刺激前有增殖，具有统计学意义(P＜0.05)，但总T细胞与初始T细胞增殖水平间无明显差异(P＞0.05);而在给予第二次刺激后与第一次刺激后比较，总T细胞增殖无明显差异(P＞0.05)，初始T细胞出现明显增殖，差异显著具有统计学意义（P＜0.05），经第二次刺激后初始T细胞增殖水平较总T细胞者增高(P＜0.05)4.将肿瘤细胞与CTL共培养后初期可见到CTL细胞聚集于B16细胞表面，随时间延长后可见到B16肿瘤细胞缩小、细胞皱缩变形、破碎裂解坏死。结果示杀伤反应后TEFFP+B16组及TEEFN+B16组B16细胞数量较单一B16组均减少(P＜0.05)，同时TEFFN+B16组B16细胞数量少于TEFFP+B16组(P＜0.05)。5.经酶标仪检测各不同反应阶段上清液中IL-2及IFN-r水平，在T细胞与TL-DC首次接触活化CTL后上清液中IL-2及IFN-r水平总T细胞组均较初始T细胞组增高(P＜0.05)，而在体外杀伤实验中所得上清液中IL-2及IFN-r水平，总T细胞组较杀伤反应前降低(P＜0.05)，而初始T细胞组较杀伤反应前升高，且明显高于总T细胞组(＜0.05)。　　结论:在体外条件下初始T细胞较总T细胞有着更强的增殖能力、细胞因子释放能力及效应细胞有更强的杀伤能力。　　第三部分、初始T细胞来源的CTL回输治疗效果观察　　目的:了解初始T细胞来源的效应细胞在体内环境中的功能特性。　　方法:依照第二部分实验方法分选T细胞，得到总T细胞及初始T细胞;应用C57BL/6小鼠通过背部皮下接种B16肿瘤细胞株制备恶性黑色素瘤的小鼠荷瘤模型;应用环磷酰胺腹腔注射干扰荷瘤小鼠肿瘤微环境;于环磷酰胺预处理后第4天，将分别1×106的TEFFP或TEFFN，经鼠尾静脉注射回输入成功荷瘤的小鼠体内进行过继性免疫治疗，并设对照组给予回输等体积PBS，于回输后72小时处死部分小鼠取肿瘤组织，CFSE标记的效应细胞组应用激光共聚焦显微镜观察荧光强度，无荧光标记组肿瘤标本应用荧光定量PCR技术检测肿瘤组织内Perfoin mRNA、granzymemRNA、IL-2 mRNA及IFN-rmRNA表达水平，剩余小鼠用于观察对比不同来源DC-CTL过继治疗对荷瘤小鼠肿瘤生长的影响，每2天测量肿瘤体积绘制荷瘤变化曲线。　　结果:　　1.腹腔注射CTX可以有效降低荷瘤小鼠外周血CD4+ CD25+ Foxp3+T细胞水平(P＜0.05)、血清TGF-β水平(P＜0.05)以及血清IL-10水平（P＜0.05），其腹腔注射CTX对于肿瘤生长未见明显影响。　　2.CFSE染色的DC-CTL细胞回输小鼠肿瘤组织制冰冻切片，激光共聚焦显微镜观察检测荧光强度提示，在肿瘤组织中均可检测到荧光染色细胞的存在，且TEFFN组较TEFFP组荧光强度高，有统计学差异(P＜0.05)。　　3.经荧光定量PCR检测肿瘤组织内Perfoin mRNA、granzyme mRNA、IL-2 mRNA及IFN-rmRNA表达情况，TEFFN组各指标表达情况均高于TEFFP组，均存在统计学差异(P＜0.05)。4.不同细胞来源的成熟DC-CTL过继治疗对荷瘤小鼠肿瘤生长的影响观察显示，空白对照组小鼠肿瘤增长明显，给予DC-CTL治疗后，小鼠肿瘤生长速度较对照组显著下降，有统计学差异，而TEFFN组小鼠肿瘤生长速度较TEFFP组为低，有统计学差异(P＜0.05)结论:初始T细胞来源的效应细胞可以表现出更强的抗瘤活性，应用细胞分选的方法对初始T细胞进行富集纯化后用于肿瘤的过继性细胞回输治疗可以有效地提高治疗效果。