目的:以维生素(VitaminD3 VD3)腹腔注射结合高脂饮食诱导的内皮损伤大鼠模型为研究对象,观察"抗栓一号"(红花、水蛭、苏木)中药复方对高脂诱导的内皮损伤的保护作用。观察"抗栓一号"中药复方在改善大鼠动物模型血脂水平的功效;观察"抗栓一号"中药复方对多种炎症因子的调控能力;并对"抗栓一号"发挥抗炎作用改善内皮损伤的作用机制进行了探讨。方法:(1)利用高效液相色谱法(HPLC)对"抗栓一号’"复方进行有效成分的分析;(2)动物实验:参照腹腔注射VD3联合高脂饲料的造模方法进行内皮损伤的造模。所有的大鼠首先用普通饲料适应性饲养1周,1周后除空白组外开始以上述的造模方法进行造模。第一次腹腔注射给予VD3 60万U·kg-1,然后在第3、6、9周时各补充VD3 10万U·kg-1,使用预先配制好的高脂饲料进行造模喂养,持续9周。将60只SD模型大鼠,随机分为:中药高剂量组、中剂量组、低剂量组,阳性药物组(瑞舒伐他汀),联合用药组(阳性药组+中药中剂量),模型组,另有10只SD大鼠为空白对照组,计7组。观察主动脉内皮HE染色结果,检测生化指标血清总胆固醇(T-CHO)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、ELISA法测白介素1β(IL-1β),白介素6(IL-6),白介素12(IL-12),肿瘤坏死因子α(TNF-α),免疫组化法检测白介素1β(IL-1β),白介素6(IL-6),白介素12(IL-12),肿瘤坏死因子αα(TNF-α)等炎症因子的表达水平;利用Western Blot和realtime-PCR方法对"抗栓一号"抗炎作用机制的研究,证实Sirt1/TLR4/NF-1κB信号通路的可行性。(3)细胞实验:参照相关文献,使用HUVEC细胞,利用ox-LDL进行诱导构造HU VEC损伤模型。取传至5-7代的HUVEC细胞,预培养后给予不同浓度ox-LDL(10ug/ml～160ug/ml),通过CCK8检测法观察ox-LDL对HUVEC增殖的抑制情况,确定ox-LDL的诱导的浓度;对5～7代的HUVEC先进行饥饿培养,再给予不同浓度的"抗栓一号"含药血清(终浓度5%、10%、20%、40%),同样利用CCK8法来观察"抗栓一号"含药血清对HUVEC的增殖影响与细胞毒性,来确定"抗栓一号"含药血清的干预浓度。将细胞分为空白组、对照组、含药血清低浓度组、含药血清中浓度组、以及含药血清高浓度组进行培养;在细胞ELISA实验中,提取细胞上清来检测白介素1β(IL-1β),白介素6(IL-6),白介素12(IL-12),肿瘤坏死因子α(TNF-α)的指标;提取各组细胞的蛋白,利用Western Blot实验方法对Sirt1/TLR4/NF-κB信号通路进行进一步验证;以含药血清(终浓度10%)为干预浓度,同时给予Sirt1蛋白抑制剂和TLR4蛋白抑制剂,利用Western B lot实验方法观察当上游基因Sirt1受到抑制与中游的TLR4蛋白收到抑制时,Sirt1/TLR4/NF-κB信号通路中各蛋白的表达情况,明确信号通路的正确性。结果:(1)高效液相分析:按照高效液相色谱法的实验步骤,从标准品中分离发现了:1.尿嘧啶核苷;2.次黄嘌呤核苷;3.鸟嘌呤核苷;4.红花黄色素A;5.巴西苏木素。(2)动物实验:①SD大鼠经9周造模后,出现高脂诱导的内皮损伤表现,通过对大鼠的胸主动脉进行HE染色。染色结果发现模型组大鼠的胸主动脉出现了血管内膜的不光滑,观察到内皮细胞排列紊乱,而且连续性较差,内皮细胞间及皮膜下出现了泡沫细胞的大量蓄积,同时血管平滑肌细胞也变现有增生的改变;此外,通过记录观察到模型组大鼠的体重与空白组相比有明显地降低;②HE染色结果:成模大鼠经过药物灌胃治疗后,HE染色结果显示,中药各剂量组、阳性药物组以及联合用药组的血管内膜与模型组相比,内膜的染色结果有较大改善,相对排列规整,内膜相对光滑,仅产生少量泡沫细胞的蓄积和平滑肌增生;③血脂水平:与空白组相比,模型组血脂水平TC、TG、LDL均提高,HDL降低,且具有统计学意义(p<0.01),各干预组与模型组相比,除低剂量组外,高、中剂量组、阳性药组、联合用药组与模型组相比,TC均有显著下降,具有统计学意义(p<0.01),低剂量组与模型组相比,TC下降趋势较低,但仍具有统计学意义(p<0.05);TG下降程度与TC各组相当,具有统计学意义(p<0.01,p<0.05),各干预组与模型组相比,LDL-c均下降且具有统计学意义(p<0.01,p<0.05),中药各干预组与模型组相比,高剂量组与中剂量组对HDL-c的改善与模型相比有统计学意义(p<0.01与p<0.05),低剂量组与模型组相比无明显差异(p>0.05);④炎症因子水平:免疫组化实验结果提示:与空白组相比,模型组IL-1β,IL-6,IL-12,TNF-α水平均提高,而各干预组与模型组相比,炎症因子的表达均下降;ELISA实验方法对血清中的炎症因子水平进行了测定,实验结果提示与空白组,模型组IL-1β,IL-6,IL-12,TNF-α水平均提高,且具有统计学意义(p<0.01),而各干预组与模型组相比,炎症因子均下降,具有统计学意义(p<0.01);⑤Sirt1/TLR4/NF-κB信号通路实验结果:通过WB和RT-PCR实验方法,实验结果表明模型组的Sirt1蛋白水平与空白组相比显著降低(p<0.01),TLR4和NF-κB显著上调(p<0.01),在经过各中药干预组干预后结果显示,中药干预后Sirt1蛋白的表达水平升高,TLR4和NF-κB下降(p<0.01或p<0.05),且调整水平与中药干预剂量呈相关性。PCR结果提示,模型组大鼠的Sirt1表达与空白组相比也有明显降低(p<0.01),TLR4和NF-κB表达明显升高(p<0.01),中药干预后的结果与WB结果一致。细胞实验:①ox-LDL与"抗栓一号"含药血清干预浓度:1.在相在相同的药物处理时间下,随着ox-LDL浓度的增加,HUVEC细胞的相对活力逐渐减少,ox-LDL对原代HUVEC细胞增殖的抑制率越大,而且抑制效果呈剂量依赖性。干预24小时后,发现80μg/mL浓度的ox-LDL对HUVEC细胞产生抑制增殖的作用,HU VEC细胞的相对活力明显降低(p<0.05)。最终使用80μg/mL浓度的ox-LDL干预HUVE C细胞,来进行相关作用与机制的研究。2.相同的药物处理时间下,实验结果发现,随着含药血清浓度的增加,HUVEC细胞的生长情况更好,而且呈剂量依赖性。而HUVEC细胞在经过40%浓度的含药血清处理后的存活率与20%的浓度出现差异(p<0.05)。最终选用含药血清浓度终浓度5%、10%、20%的三个给药剂量,以此三种浓度的含药血清进行干预,来研究对ox-LDL诱导的HUVEC细胞损伤的作用与作用机制。②炎症因子水平:ELISA实验方法对细胞上清中的炎症因子水平进行了实验,实验结果提示与空白组相比,ox-LDL干预组IL-1β,IL-6,IL-12,TNF-α水平均提高,且具有统计学意义(p<0.01),而含药血清干预组与ox-LDL干预组相比,炎症因子均下降,具有统计学意义(p<0.01),且与浓度呈相关性;③Sirt1/TLR4/NF-κB信号通路实验结果:与空白对照组相比,ox-LDL干预组的Sirt1蛋白水平明显下调,TLR4、NF-κB蛋白水平明显上调,具有统计学意义(p<0.01);经过"抗栓一号"含药血清干预后,Sirt1蛋白水平出现明显升高,相应的,TLR4、NF-κB蛋白水平明显下调,且蛋白的调整水平与含药血清干预的浓度有相关性,其中10%与20%浓度的含药血清对蛋白的调整与模型组相比,下调具有统计学意义(p<0.01),5%浓度的含药血清对蛋白的调整与模型组相比,调整趋势较低(p<0.05);加入Sirt1蛋白抑制剂后,"抗栓一号"含药血清干预ox-LDL诱导的HUVEC引起的Sirt1上调程度与未加蛋白抑制剂相比,Sirt1上调程度有明显差异(p<0.01);同时TLR4与NF-kB的蛋白表达两组间也有明显差异(p<0.01,p<0.05);加入TLR4蛋白抑制剂后,"抗栓一号"含药血清干预ox-LDL诱导的HUVEC引起的TLR4下调调程度与未加蛋白抑制剂相比,TLR4下调程度有明显差异(p<0.01);此外,而NF-κB的蛋白表达两组之间也有明显差异(p<0.05),Sirt1蛋白表达两组间而无明显差异。结论:(1)高效液相色谱法可以用来进行中药复方制剂有效成分的分析;(2)给予SD大鼠腹腔注射VD3联合高脂饮食可以用来作为内皮损伤动物模型的造模方法;(3)"抗栓一号"中药复方可以改善高脂诱导内皮损伤大鼠血清中的血脂水平,降低TC、TG、LDL-c,升高HDL-c来缓解内皮损伤;(4)"抗栓一号"中药复方可以下调高脂诱导内皮损伤大鼠血清与ox-LDL诱导的H UVEC细胞上清中的IL-1β,IL-6,IL-12,TNF-α水平,降低大鼠胸主动脉中的IL-1β,IL-6,IL-12,TNF-α水平的表达,起到抑制炎症改善内皮损伤的作用;(5)Sirt1/TLR4/NF-κB信号通路可能是炎症干预内皮损伤的新的通路;行气活血方"抗栓一号"可以通过Sirt1/TLR4/NF-κB信号通路改善炎症反应来抑制高脂诱导的内皮损伤,从而缓解动脉粥样硬化进程。