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目的1对海洋沉积物进行系列性筛选,以获得全新来源并具有潜在高性能的海因酶,并提供一种全新的海因酶阳性菌筛选体系和一种全新的酶优化手段。2构建快速筛选模型,筛选性能更优的海因酶突变体,并为同类酶的优化提供依据。3对海因酶工程菌进行固定化研究,获得全细胞固定海因酶产生菌的最优配方,为D-对羟基苯甘氨酸的工业化生产奠定基础。方法1以实验室保存的链霉菌库为筛选对象,利用唯一氮源法、双层琼脂法、微孔快速筛选法和分子生物学筛选法对其进行系列性筛选,获得可表达海因酶的阳性链霉菌;从筛选获得阳性菌中扩增目的片段,分析基因序列并进行工程菌构建;测定海因酶的酶活和动力学参数;利用Swiss-model在线软件对海因酶进行在线同源建模和Caver Analyst软件对其的催化通道进行结构模拟分析;2利用易错PCR构建海因酶突变库;构建快速筛选模型进行突变酶筛选;对突变酶的酶学性质进行测定;3利用海藻酸钠作为固定载体,对海因酶工程菌进行全细胞固定化研究;优化海藻酸钠浓度、硅藻土浓度、戊二醛浓度、Ca Cl2浓度和Mn Cl2浓度;测定固定化小球的最适直径和最适添加浓度;测定固定化全细胞小球的批次实验次数;测定固定化全细胞小球的机械强度。结果1筛选获得四株阳性菌,分别命名为S1、S14、S29和S145菌株,随后对不同菌株来源的海因酶的酶动力学参数进行测定,结果显示,S145菌株来源的海因酶活性最高,为9.7 U/mg,催化动力学常数Kcat=3.2×10-6/s,Km=9.5 mmol/L;海因酶结构的同源模建和催化通道模拟分析,结果显示其主要催化通道Tunnel1长度为9.1?,瓶颈氨基酸残基为50位的组氨酸、181位的组氨酸和313位的谷氨酸,瓶颈半径为2.18?;潜在催化通道Tunnel2长度为13.6?,瓶颈氨基酸为62位的苏氨酸、93位的天冬酰胺和107位的色氨酸,瓶颈半径为1.52?;2筛选出七株阳性突变菌,突变位点主要集中在181位和286位;181位突变菌的酶活为11.5 U/mg,对产物的耐受力提高10%;286位突变菌的酶活为11.0 U/mg,对底物的耐受力提高11%;3获得固定化细胞的最优配方为:3.0%海藻酸钠、1.5%硅藻土、0.05%Ca Cl2和1.0 m M Mn Cl2;固定化小球最适直径位2.6 mm,所占浓度最适为20%;固定化全细胞小球可重复使用12批次,其催化生产产物的产率为88%以上。结论1开发了一种海因酶系列筛选策略,获得潜在的酶优化位点,为后期酶的优化提供理论基础;2筛选获得了性能更优的突变海因酶;3制备了高性能固定化细胞的固定化配方,从而为酶法工业生产D-对羟基苯甘氨酸成为可能。