目的:肺癌在全球的发病率和死亡率均名列前茅。尽管现代社会关于肺癌的诊疗条件和救治水平有了很大进步,大部分患者仍得不到及时有效的控制,给全球医疗带来了沉重的负担。肺癌根据组织学类型分为小细胞肺癌（Small cell lung cancer,SCLC）和非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer,NSCLC）两大类,其中非小细胞肺癌（NSCLC）占肺癌患者的80%-85%。近年来,针对NSCLC的手术、化疗、放疗和靶向抗体药治疗等研究均取得了较大的进展。然而仍有许多严峻的问题需要解决,主要包括:肿瘤细胞的异质性带来的药物敏感性差异、患者不可避免出现耐药和转移的问题,严重的药物副作用,以及治疗靶点有限等问题,严重影响了NSCLC的临床治疗效果。因此,深入揭示NSCLC的发病机制,鉴定NSCLC的新靶点,探索新的治疗策略,具有重要的理论意义和临床价值。原肌球蛋白调节蛋白3（Tropomyosin regulatory protein 3,TMOD3）属于尖端盖帽蛋白家族,参与尖端肌动蛋白丝的力学信号的调节。肌动蛋白丝是所有类型细胞中细胞骨架的重要组成部分,F-肌动蛋白具有倒刺和尖头两个结构,聚合和解聚发生在两端,然而,聚合速度更快的是在倒刺端,肌动蛋白丝在倒刺端持续聚合,从尖端开始解聚。TMOD3可以阻断肌动蛋白丝在尖端的伸长和解聚,通过调节肌动蛋白动态变化,促进细胞的形态确定、迁移和肌肉收缩等多种生理过程。同时,TMOD3也可以通过与肌动蛋白结合而封存肌动蛋白单体或使肌动蛋白聚合成核。TMOD3相关的疾病包括肌萎缩性嵴髓侧索硬化症5型和芳香化酶过剩综合征。有研究表明,TMOD3在癌细胞的迁移和有丝分裂中起到关键作用。也有研究报道,TMOD3的激活与肝癌和食管癌的发生发展有关。TMOD3能够通过稳定肌动蛋白-肌球蛋白丝来控制突出结构和收缩结构之间的平衡。但是,总体上来说关于TMOD3在肿瘤中的研究报道还偏少,其潜在的调控功能和机制研究尚需要进一步研究阐明。铁死亡（Ferroptosis）是一种依赖铁离子及活性氧诱导脂质过氧化导致的程序性细胞死亡。其本质为诱导剂导致谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase,GPXs）的活性降低,引发膜脂ROS的积累和细胞氧化性死亡。已经有研究表明,AKT信号通路的激活通过SREBP介导的脂肪形成抑制肿瘤细胞的铁死亡。并且发现,铁死亡信号调控的三个关键基因GPX4,x CT和FACL4在肿瘤细胞铁死亡进程中发挥关键的调控作用。诱导铁死亡能够导致肿瘤细胞生长受到抑制,显著提高肿瘤的治疗效果,使其成为了癌症治疗的重要靶标,未来可能成为一种有效的癌症治疗策略。腺苷酸琥珀酸裂解酶（Adenylate succinate lyase,ADSL）是嘌呤从头合成的必需酶,其催化嘌呤合成的两个步骤为:（1）琥珀酰氨基咪唑碳酰胺核糖苷转化为氨基咪唑碳酰胺核糖苷;（2）腺苷酸琥珀酸转化为一磷酸腺苷;研究报道,人类ADSL基因定位在22q13.1-q13.2染色体上,最初的研究发现,人类ADSL的缺陷已被证明容易患上具有自闭症特征的神经发育综合征。ADSL缺乏症是一种隐性遗传疾病,可导致多种但最常见的是严重的智力迟钝,经常伴有癫痫和/或自闭症。研究报道,高通量尿液筛查技术可以作为ADSL缺乏症患者的早期诊断方法,进而发现突变后的ADSL酶功能受到严重影响,导致病人尿代谢异常。近期研究发现,ADSL参与多种肿瘤的发生过程。研究发现,抗癌药物靶标（ADTs）在生物通路中的拓扑特性发现ADSL可以作为抗癌药物的研发靶标。ADSL是三阴性乳腺癌（TNBC）的致癌驱动因子,通过驱动癌基因C-MYC表达,促进乳腺癌的恶性进展。ADSL通过细胞周期途径在前列腺癌发生发展中起致癌作用。另有研究报道,ADSL通过影响线粒体功能促进结直肠癌的恶性进展。但是,截至目前,尚未有ADSL与NSCLC的研究报道。此前已有研究报道,铁死亡在非小细胞肺癌的恶性进展和治疗中均发挥至关重要的作用。因此在非小细胞肺癌恶性进展中,探究铁死亡的调节机制,对阐明非小细胞肺癌发生发展的分子调控网络,挖掘NSCLC的治疗靶点具有重要意义。本课题研究发现TMOD3在NSCLC中高表达,确立了TMOD3可能作为非小细胞肺癌中一种新的促癌基因的证据;同时,发现TMOD3能够调控非小细胞肺癌细胞的铁死亡水平,并通过蛋白互作技术和蛋白质质谱分析测序技术建立了TMOD3与ADSL两者的靶向调控关系;综上研究,研究团队作出科学假设:TMOD3通过抑制ADSL表达介导AKT信号激酶的活化,来调控非小细胞肺癌细胞铁死亡进程,建立了TMOD3与非小细胞肺癌铁死亡的联系的同时,发现了TMOD3与铁死亡信号调控作用因子ADSL在非小细胞肺癌铁死亡调控中的证据链。研究方法:1、本课题选取了中国医科大学附属第一医院2014年到2016年,进行手术切除后并经病理确诊的非小细胞肺癌（NSCLC）患者病例95例。所有参与本次病理相关性分析的95例患者,手术前均未接受过放疗和化疗。免疫组化分析了TMOD3在非小细胞肺癌中高表达且有临床病理相关性。2、利用GEPIA数据库在线分析TMOD3基因与NSCLC患者预后的关系。3、选取NSCLC细胞系A549,SK-MES-1,H1299,H460和HBE2（正常肺上皮细胞对照）等细胞系（Caco2细胞做无关对照）,Western Blot筛选出TMOD3高表达的肺腺癌细胞株A549和肺鳞癌细胞株SK-MES-1。4、si RNA-TMOD3敲降:合成靶向TMOD3的si RNA序列,转染A549和SK-MES-1细胞,收取细胞提取细胞总蛋白,Western Blot检测确认最佳敲降序列。5、细胞增殖活性实验:96 well小室中铺A549细胞（si RNA-NC/Control,si RNA-TMOD3）和SK-MES-1细胞（si RNA-NC/Control,si RNA-TMOD3）,每组铺4复孔,每隔24h按照CCK8试剂说明书配制试剂,加入细胞孔内,酶标仪OD450检测吸光度,对照组在铺细胞4h后加入CCK8试剂上机检测,统计分析每个时间点的吸光度,绘制细胞增殖曲线。6、细胞克隆:6 well板中铺A549细胞（si RNA-NC/Control,si RNA-TMOD3）和SK-MES-1细胞（si RNA-NC/Control,si RNA-TMOD3）,细胞持续增殖7-14天,收集细胞,结晶紫染色后,拍取细胞克隆图片,比较细胞增殖活性差异。7、细胞划痕实验:6 well板中铺A549细胞（si RNA-NC/Control,si RNA-TMOD3）和SK-MES-1细胞（si RNA-NC/Control,si RNA-TMOD3）,次日细胞增殖至50%-60%密度,使用无菌黄色枪头,沿孔板中间垂直从上到下刮去孔板板底细胞,移除培养基,PBS清洗一次细胞,加入新鲜完全培养基,细胞继续培养96h,每隔24h对划痕处进行拍照,最终测量划痕之间的距离并转换数据统计分析。8、细胞侵袭实验:在8 um,24 well小室中铺A549细胞（si RNA-NC/Control,si RNA-TMOD3）和SK-MES-1细胞（si RNA-NC/Control,si RNA-TMOD3）,细胞侵袭48h收取Transwell小室,染色,显微镜下计数侵袭细胞数并统计分析。9、Western Blot检测增殖及周期信号蛋白:6 well板中铺A549细胞（si RNA-NC/Control,si RNA-TMOD3）和SK-MES-1细胞（si RNA-NC/Control,si RNA-TMOD3）,细胞密度达到90%以上,收取细胞,加入M2型蛋白裂解液收取蛋白,SDS-PAGE跑胶,检测相关指标的表达。10、Western Blot检测肿瘤EMT蛋白:6 well板中铺A549细胞（si RNA-NC/Control,si RNA-TMOD3）和SK-MES-1细胞（si RNA-NC/Control,si RNA-TMOD3）,细胞密度达到90%以上,收取细胞,加入M2型蛋白裂解液收取蛋白,SDS-PAGE跑胶,检测EMT相关指标的表达。11、Fe离子检测:6 well板中铺A549细胞（si RNA-NC/Control,si RNA-TMOD3）和SK-MES-1细胞（si RNA-NC/Control,si RNA-TMOD3）,加入Ferroptosis激活剂Erastin刺激细胞一定时间,细胞密度达到90%以上,收取细胞上清,按照Fe离子检测试剂盒操作,检测不同组间Fe离子的含量差异。12、ROS-脂质活性氧酶检测:6 well板中铺A549细胞（si RNA-NC,si RNA-TMOD3-1,si RNA-TMOD3-2）和SK-MES-1细胞（si RNA-NC,si RNA-TMOD3-1,si RNA-TMOD3-2）,细胞密度达到90%以上,收取细胞,按照ROS检测步骤操作细胞,标记细胞ROS,流式上机检测细胞内脂质活性氧的差异。13、TMOD3-sh RNA稳定株构建:合成TMOD3-sh RNA质粒并包装慢病毒,感染A549和SK-MES-1细胞,2ug/ml嘌呤霉素完全培养基筛选稳定株,Western Blot检测TMOD3敲降表达。14、细胞内谷胱甘肽检测:6 well板中铺A549细胞（sh RNA-NC/Control,sh RNA-TMOD3）和SK-MES-1细胞（sh RNA-NC/Control,sh RNA-TMOD3）,细胞密度达到90%以上,收取细胞,加入GSH试剂裂解细胞,按照试剂盒操作,检测不同组间细胞内GSH的含量差异。15、Western Blot检测铁死亡信号AKT和铁死亡转录因子表达:6 well板中铺A549细胞（sh RNA-NC/Control,sh RNA-TMOD3）和SK-MES-1细胞（sh RNA-NC/Control,sh RNA-TMOD3）,细胞密度达到90%以上,收取细胞,加入M2型蛋白裂解液收取蛋白,SDS-PAGE跑胶,检测铁死亡调控信号相关指标的表达。16、Co-IP＆MS免疫沉淀联合质谱分析:构建人源TMOD3-Flag融合表达质粒,转染A549细胞系,转染72 h后收取细胞,加入IP裂解液收取蛋白,IP抗体Anti-Flag与Protein A/G Beads加入到蛋白混合液,钓取TMOD3-Flag蛋白及其相互作用蛋白复合物,蛋白质谱分析筛选TMOD3互作蛋白。17、Co-IP蛋白-蛋白互作验证:Co-IP免疫共沉淀验证TMOD3与ADSL的互作,在A549过表达TMOD3-Flag转染体系和A549内源蛋白互作体系下进行。18、利用GEPIA数据库在线分析TMOD3基因与ADSL基因在NSCLC中的关系。19、TMOD3通过抑制ADSL调控NSCLC铁死亡信号。合成敲降ADSL序列的si RNA（si RNA-NC/Control对照）,转染A549-sh RNA-TMOD3细胞系,收取细胞并提取总蛋白,Western Blot检测铁死亡调控的关键转录因子和对AKT信号的影响。研究成果:1、在肺腺癌和肺鳞癌中,TMOD3定位于细胞核和细胞浆,我们对所有表达的TMOD3进行统计评分。在正常肺支气管和肺泡中,TMOD3的表达量较肺癌组织中TMOD3表达水平低,随着分化程度降低,TMOD3表达水平呈增多趋势。2、筛选出两株高表达TMOD3的肺腺癌细胞系A549和肺鳞癌细胞系SK-MES-1,合成si RNA-TMOD3敲降序列,并确定TMOD3最佳敲降序列。3、肿瘤功能表型研究发现,A549和SK-MES-1中敲低TMOD3后,细胞增殖活性,细胞迁移,细胞侵袭和EMT上皮间质转化等功能受到抑制。4、A549和SK-MES-1细胞系中Western Blot检测发现,TMOD3抑制了Cyclin B1、Cyclin D1、CDK2等增殖和周期调控蛋白的表达。5、A549和SK-MES-1细胞系中Western Blot检测发现,细胞上皮标志物E-Cadherin表达增加,间质标志物N-Cadherin表达下调。6、A549和SK-MES-1细胞系中,TMOD3抑制了NSCLC细胞铁死亡进程,抑制铁离子的水平,加入铁死亡激活剂Erastin,效应更加明显。7、A549和SK-MES-1细胞系中,TMOD3抑制了NSCLC细胞铁死亡进程,促进了谷胱甘肽的表达。8、A549和SK-MES-1细胞系中,TMOD3抑制了NSCLC细胞铁死亡进程,ROS脂质活性氧表达水平上升。9、A549和SK-MES-1细胞系中Western Blot检测发现,TMOD3促进铁死亡经典信号激酶AKT和ERK磷酸化;同时,TMOD3促进了铁死亡抑制基因x CT和GPX4的表达,并抑制了铁死亡促进基因FACL4的表达。10、Co-IP免疫共沉淀联合MS-质谱分析,筛选到TMOD3互作蛋白ADSL,并通过正反向互作实验证明,外源表达TMOD3-Flag和内源表达TMOD3均可以与ADSL发生互作;并通过Western Blot发现TMOD3抑制ADSL的表达。11、A549-si RNA-TMOD3细胞系中转染si RNA-ADSL,Western Blot检测发现与转染si RNA-NC/Control组相比,p-AKT和p-ERK磷酸化水平显著上调;抑制基因x CT和GPX4的表达显著上调;铁死亡促进基因FACL4表达显著下调。说明TMOD3通过抑制ADSL的表达,介导NSCLC细胞AKT铁死亡信号的调控,从而促进NSCLC的恶性进展。结论:1、TMOD3的高表达与肿瘤淋巴结转移、TNM分期及预后等不良病理特征有关,是NSCLC中潜在的新促癌基因;2、TMOD3促进NSCLC细胞系A549和SK-MES-1的细胞增殖、迁移、侵袭和上皮-间质转化（EMT）;3、TMOD3与ADSL蛋白存在相互作用,通过激活AKT/ERK信号通路,负向调控NSCLC细胞的铁死亡进程。