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玛咖酰胺是玛咖中特有的一类酰胺类活性化合物,由于其具有广泛的生物学活性而成为关注热点。然而玛咖酰胺种类多、含量低、天然来源的单体分离提取困难,导致玛咖酰胺的药理药效研究局限于提取物、组分等整体的活性考察和药效评价,且药理作用靶点尚不明确。因此,建立一套高效、便捷、系统的玛咖酰胺单体的合成和制备工艺,并考察不同结构特征的玛咖酰胺单体的生物学活性,进而探寻其活性差异的结构来源和分子规律,可为玛咖产业健康发展和玛咖酰胺的药理药效提供更明确的技术支持和理论基础。基于此,本课题拟采用碳二亚胺类缩合法建立一种玛咖酰胺合成方法,结合体内动物实验评价不同玛咖酰胺单体的缓解体力疲劳作用和抗辐照损伤作用。通过高饱和度的N-苄基十六碳酰胺(N-benzylhexadecanamide,NBH)、高不饱和度的N-苄基二十二碳六烯酸酰胺(N-benzyldocosahexaenoicacidamide,NBDHA)及乙酯化二十二碳六烯酸(ethyl esterified docosahexaenoicacid,DHA-EE)之间对比,探讨玛咖酰胺单体结构与生物学活性之间的特征和规律。研究目的:开发不同饱和度的、具有典型玛咖酰胺结构特征的化合物的合成和制备工艺;通过建立小鼠疲劳和辐照损伤动物模型,评价所制备玛咖酰胺单体的相关生物学活性并探讨其活性来源。研究方法:1.玛咖酰胺的合成制备与结构解析 采用碳二亚胺类缩合法合成玛咖酰胺及其类似物,利用皂化反应、低温重结晶、液相色谱法纯化化合物,采用高效液相(HPLC)、红外(IR)、液质联用(LC-MS)和核磁共振(NMR)等技术鉴定化合物结构。2.玛咖酰胺缓解体力疲劳作用 建立小鼠体力疲劳模型,随后测量小鼠体重变化及负重游泳时间,检测小鼠相关生物学指标,血乳酸(Blood Lactic Acid,BLA)、血尿素氮(Blood Urea Assay,BUN)、肝/肌糖元(Liver/Muscle glycogen,LG/MG)血清中乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、肌酸激酶(Creatine kinase,CK)活性游离脂肪酸(Nonesterified Free fatty acids,NEFA)、血氨(Blood Ammonia,BA)含量,总超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)水平,病理学检测相关组织病变情况。3.玛咖酰胺改善小鼠辐照损伤作用 建立小鼠辐照损伤模型,探索适当的辐照剂量,在此基础上辐照后,连续灌胃7天,随后检测体重变化、血液中外周血细胞计数,脾脏指数及病理情况,血清中SOD、MDA水平变化,骨头病理情况,流式检测骨髓细胞凋亡和表面干细胞增殖情况,QT-PCR检测相关基因表达情况。研究结果:1.玛咖酰胺的合成制备与结构解析 利用碳二亚胺类缩合法成功合成两种玛咖酰胺化合物,N-苄基十六碳酰胺为白色粉末,N-苄基二十二碳六烯酸酰胺为淡黄色油状。纯化后经高效液相检测两种化合物纯度>95%以上,产率>30%。经红外、液质联用以及核磁共振鉴定化合物为N-苄基十六碳酰胺和N-苄基二十二碳六烯酸酰胺。2.玛咖酰胺缓解体力疲劳作用 两种玛咖酰胺化合物均能延长小鼠的负重游泳时间。各种生物学指标检测结果显示两种玛咖酰胺化合物能降低BLA和BUN水平、L DH和CK的水平;增加LG和MG水平;降低血清MDA含量、增加SOD活性;组织学分析表明,两种玛咖酰胺化合物对运动过程中小鼠骨骼肌、心肌细胞和肝脏具有保护作用。3.玛咖酰胺改善小鼠辐照损伤作用 选取6.0 Gy剂量为半数致死量;各给药组小鼠体重减轻情况有所缓解;各给药组能够增加血液中的白细胞、红细胞、血红蛋白、血小板的数量;增加了血清中SOD的活性、MDA的水平下降;脾脏指数均有所增加,脾脏病变情况有所缓解,骨头中有核数量增加,空泡情况减少;各给药组中骨髓细胞数量增多,凋亡情况减少,干细胞比例增多;各给药组可能通过NRF-2、IL-3、P53、CyclinD1基因介导骨髓细胞的增殖,从而恢复造血功能。结论:本课题基于碳二亚胺类缩合法,成功制备出两种典型的玛咖酰胺类化合物:天然玛咖中含量最高的高饱和度N-苄基十六碳酰胺,以及天然玛咖中尚未发现的潜在最高不饱和度的N-苄基二十二碳六烯酸酰胺。其中N-苄基十六碳酰胺纯度为98%,产率为39.15%;N-苄基二十二碳六烯酸酰胺纯度>95%以上,产率为30.12%。基于疲劳小鼠模型和辐照损伤小鼠模型,考察了N-苄基十六碳酰胺、N-苄基二十二碳六烯酸酰胺和乙酯化二十二碳六烯酸的缓解体力疲劳和抗辐照损伤作用。结果表明,三种化合物对疲劳小鼠和辐照损伤小鼠均具有显著缓解作用,高不饱和度的N-苄基二十二碳六烯酸酰胺和乙酯化二十二碳六烯酸的总体改善程度优于高饱和度的N-苄基十六碳酰胺,N-苄基二十二碳六烯酸酰胺和乙酯化二十二碳六烯酸的改善效果相当。分析认为,玛咖酰胺类化合物的活性来源主要为脂肪酸链,且抗疲劳与抗辐照损伤活性与脂肪酸链的不饱和度存在一定相关性。