研究背景及目的:恶性肿瘤是全球面临的主要公共健康问题,为目前医学研究领域的重大课题,尤其在中国,每年肝癌新发病例数为36.6万人,位居全国癌症发病的第3位,肝癌每年死亡病例为32.1万,位居全国癌症死亡第2位。肝癌的发生是一个多因素作用的结果,其病因尚未完全清楚,肝炎病毒感染(HBV,HCV等)、酒精肝、脂肪肝、黄曲霉毒素等是肝癌发生的公认致癌因素。外科手术切除及介入微创治疗为目前有可能根治肝癌的方法,但对于大部分不能手术切除的中晚期肝癌患者,目前采用TACE、PEI、RFA、放疗、中医药等综合治疗以提高患者生活质量、延长生存期。中医药研究是一个值得深入开发和探讨的领域,抑制肿瘤细胞增殖及侵袭作为现在的一个研究热点,从天然药物中,尤其是现有中药中寻找到抗肿瘤细胞增殖及侵袭的药物并发现其中的相关机制,成了新药研发的一个新方向和热点。野菊花为清热解毒类药物,被广泛运用于临床抗肿瘤的治疗,在临床运用中已经取很多抗肿瘤的相关经验和实验支持,但对于野菊花抗肿瘤细胞增殖及侵袭的相关作用机制方面研究较少,并不能系统、客观地反映野菊花水提对肝癌细胞生长的作用及机制。本课题选用人肝癌细胞HepG2作为研究对象,采用野菊花水提物处理该细胞,观察野菊花水提物对人肝癌细胞HepG2后细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭等情况,并探索潜在的分子机制,为野菊花治疗肝癌提供客观的实验依据。研究方法:1、制备野菊花水提物,运用高效液相色谱法测定中药野菊花水提物的指纹图谱,为本实验的药物质量提供了有效的参考,确保提取物的质量,保证了之后几部分实验结果的可重现性。2、分别以不同浓度野菊花水提物(1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、250μg/ml、500μg/ml)处理HepG2细胞和正常人肝细胞LO2,采用MTT法分别检测野菊花水提物对HepG2细胞及LO2细胞的抑制率,并计算野菊花水提物对HepG2细胞作用的IC50和IC30;3、将细胞HepG2细胞分为3组:野菊花水提物组(22μg/ml,IC30)、空白对照组、阴性对照组(DMSO),采用MTT法绘制给药后HepG2细胞4天的生长曲线;4、将细胞HepG2细胞分为3组:野菊花水提物组(22μg/ml,IC30)、空白对照组、阴性对照组(DMSO组),将HepG2细胞培养24h,进行EdU细胞增殖实验检测细胞的增殖情况;并采用流式细胞术(PI染色)测定细胞周期。5、将细胞HepG2细胞分为3组:野菊花水提物组(50μg/ml,IC50)、空白对照组、阴性对照组(DMSO),将HepG2细胞培养24h,采用CSFE/PI及Annexin V-FITC/PI双染色法检测细胞凋亡;6、将细胞HepG2细胞分为3组:野菊花水提物组(22μg/ml,IC30)、空白对照组、阴性对照组(DMSO),进行细胞划痕实验和Transwell侵袭实验,检测野菊花水提物对HepG2细胞迁移及侵袭的影响;7、以野菊花水提物(22μg/ml,IC30)处理HepG2细胞24h,利用实时荧光定量PCR技术和半定量western blot检测野菊花水提物处理细胞后,与细胞增殖、迁移及侵袭相关基因Cyclin D1、Cyclin E2、COX2、MMP2、MMP9的表达情况;8、以野菊花水提物(50μg/ml,IC50)处理HepG2细胞24h,利用实时荧光定量PCR技术和半定量western blot检测野菊花水提物处理细胞后,与细胞凋亡相关基因Bcl-2、Bax、Fas的表达情况。研究结果:1、供试品野菊花水提物7个共有峰中,峰3与对照品绿原酸相似,且相似度大于0.90,峰4与对照品木犀草苷相似,且相似度大于0.90;2、野菊花水提物能够抑制HepG2细胞增殖,且随药物浓度增加而明显增强(P<0.01);测得24小时野菊花水提物对HepG2细胞的IC30和IC50分别为21.45±1.08μg/ml和52.72±l.64μg/ml;野菊花水提物对正常肝细胞LO2的毒性较小。3、MTT法绘制野菊花水提物(22μg/ml,IC30)作用于HepG2细胞后的生长曲线,显示野菊花水提物对HepG2细胞的生长具有抑制作用。4、EdU细胞增殖实验显示野菊花水提物组S期细胞数比例为24.61±1.08%,阴性对照组(DMSO)为36.15±3.21%,空白对照组为39.28±4.29%,野菊花水提物组处于S期细胞数比例显著减少(P?0.01);流式细胞术(PI染色)测定细胞周期,显示野菊花水提物组HepG2细胞处于G0/G1期的细胞比例为68.1%,S期细胞比例为28.3%,阴性对照组(DMSO)处于G0/G1期的细胞比例为53.8%,S期细胞比例为38.2%,空白对照组处于G0/G1期的细胞比例为53.5%,S期细胞比例为38.4%,野菊花水提物组G0/G1期细胞数较空白对照组及阴性对照组(DMSO)增多,S期细胞减少(P<0.01);5、CSFE/PI双标法检测显示:野菊花水提物组CFSE/PI双阳性细胞数为23.6±2.35%,阴性对照组(DMS0)为4.28±1.02%,空白对照组为2.64±1.16%;野菊花水提物组较空白对照组和阴性对照组(DMSO)双阳性细胞数比例显著增加(P<0.01);Annexin V-FITC/PI双染色法:野菊花水提物组、阴性对照组(DMSO)、空白对照组的细胞凋亡率分别为:20.16±2.17%、4.36±0.48%、3.92±0.61%,野菊花水提物组凋亡率较阴性对照组(DMSO)和空白对照组显著增加(P<0.01);6、划痕实验显示野菊花水提物组、阴性对照组(DMSO)、空白对照组的24h的划痕相对愈合宽度为20.57±1.78%、32.91±1.93%、33.92±2.18,野菊花水提物组划痕相对愈合宽度小于阴性对照组(DMSO)及空白对照组(P<0.01);Transwell侵袭实验显示:野菊花水提物组、阴性对照组(DMSO)、空白对照组穿过Transwell小室基底膜的细胞数分别为:103.25±14.38、196.81±18.25、204.76±30.94,野菊花水提物组穿过Transwell小室基底膜的细胞数显著少于阴性对照组(DMSO)及空白对照组(P<0.01)。7、实时荧光定量PCR和半定量western blot显示野菊花水提物能够下调HepG2细胞Cyclin D1、COX2、MMP2、MMP9、Bcl-2基因的表达,上调Bax基因的表达,对Cyclin E2、Fas基因表达无明显影响。结论:1、野菊花水提物对HepG2细胞的增殖具有抑制作用,同时能够诱导HepG2细胞凋亡,抑制HepG2细胞的迁移及侵袭能力;2、野菊花水提物抑制HepG2细胞增殖、促进HepG2细胞凋亡的分子机制可能与下调Cyclin D1、Bcl-2基因的表达和上调Bax基因的表达有关;3、野菊花水提物抑制HepG2细胞迁移和侵袭的分子机制可能与下调COX2、MMP2、MMP9基因的表达有关。