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目的:观察新生大鼠缺氧缺血性脑损伤(HIBD)后松果体内miR-182及钟基因Clock的表达变化,并观察miR-182过表达/表达沉默时对体外培养松果体细胞钟基因Clock的影响,分析miR-182与Clock表达之间的调控关系,研究miR-182在HIBD导致的昼夜节律紊乱中的作用。方法:应用实时荧光定量PCR法(RT-PCR)测定miR-182在正常大鼠各组织(肺、肠、胃、肾、大脑皮层、松果体组织)中的表达差异。将7日龄的新生Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分为HIBD模型组和假手术组,根据Rice-Vannucci法制作HIBD模型,分别利用RT-PCR技术和Western blot法测定两组在缺氧缺血后0 h、24 h、48 h、72 h松果体中miR-182、靶基因Clock mRNA及Clock蛋白的表达水平。无菌手术下分离得到新生大鼠松果体,采用胰酶消化、差速贴壁分离等方法获得松果体细胞,体外培养并传代,利用倒置显微镜观察细胞生长情况,CCK-8测定细胞增殖情况,5-HT及MAP-2免疫荧光法鉴定松果体细胞。使用miR-182过表达/表达沉默慢病毒转染体外培养的松果体细胞,转染成功后分别利用RT-PCR技术和Western blot法测定松果体细胞中Clock mRNA以及Clock蛋白的表达水平。结果:1、RT-PCR结果显示mi R-182在松果体组织中高丰度表达。2、HIBD组在HIBD模型制备后24 h、48 h,mi R-182的表达水平高于对应时间点的假手术组(P<0.05),0 h、72 h与假手术组相比差异均无统计学意义(P>0.05),HIBD模型制备后24 h miR-182水平开始升高,持续至48 h。与对应时间点的假手术组相比,HIBD组在HIBD模型制备后0 h Clock mRNA表达水平升高,48 h时降低,72 h后明显升高(P<0.05),24 h差异无统计学意义(P>0.05)。3、与对应时间点假手术组相比,HIBD组在HIBD模型制备后0 h Clock蛋白的表达水平降低,72 h Clock蛋白的表达水平升高(P<0.05),而24 h、48 h Clock蛋白的表达差异无统计学意义(P>0.05)。4、采用胰酶消化、差速贴壁分离等方法并结合DMEM/F12培养基培养,体外可获得纯度较高且有增殖潜力的大鼠松果体细胞。5、与对照组相比,实验组松果体细胞中过表达或表达沉默miR-182,Clock mRNA的表达差异均无统计学意义(P>0.05)。与对照组相比,实验组松果体细胞中过表达miR-182,Clock蛋白的表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.05);与对照组相比,实验组松果体细胞中miR-182表达沉默,Clock蛋白的表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:松果体中miR-182可能在转录后水平调控Clock基因的表达,mi R-182可能通过调控靶基因Clock参与了松果体HIBD后昼夜节律紊乱的病理生理过程。