研究背景深低温保存是目前长期储存脂肪来源干细胞（adipose-derived stem cells,ASCs）的唯一方法,解冻复苏后仍具备良好性能的脂肪来源干细胞是建立ASCs干细胞库和临床应用的必要条件。无论是应用于临床还是基础研究,均要求提供的储存干细胞的质量是优化的、稳定的和均一的。但目前ASCs干细胞库的细胞来源缺乏统一的标准,细胞质量非常不稳定,生物学活性差异很大。要获得质量最佳、生物学特性稳定一致的深低温保存ASCs,就必须在细胞来源方面对相关因素加以严格控制。目前,影响脂肪来源干细胞性能的关键因素包含供体年龄、部位和吸脂方法。由于缺乏针对深低温保存的ASCs细胞来源的系统优化研究和数据,尚无法对上述因素进行控制和优化。因此,需要明确供体因素和采集方法对脂肪来源干细胞深低温保存后的生物学特性的影响,了解不同年龄、不同部位和不同采集方法获取的脂肪来源干细胞在深低温保存后生物学特性有何差异,为优化脂肪干细胞采集指标提供基本数据,为建立人ASCs干细胞库标准提供依据。研究目的明确年龄因素对脂肪来源干细胞深低温保存后生物学特性的影响;明确不同供区部位的脂肪来源干细胞深低温保存后生物学特性的差异;比较水动力辅助吸脂技术和常规负压吸脂技术对冷冻脂肪来源干细胞生物学特性的影响;探讨不同年龄、供体部位、吸脂技术来源的冷冻脂肪来源干细胞辅助脂肪移植的效果。研究方法第一部分:不同年龄供体脂肪来源干细胞深低温保存后生物学特性的比较（1）冷冻ASCs生物学特性检测:健康女性腹部脂肪抽吸术中获取的颗粒脂肪组织。按供体年龄分为:A组18～29岁,B组30～49岁,C组50～65岁,每组20例。采用胶原酶分离获得SVF（stromal vascular straction,SVF）,应用Muse细胞分析仪检测各组脂肪中SVF的产量和活力;体外培养获得P2代ASCs,深低温保存4周,流式细胞仪检测冷冻ASCs干细胞表面标志物表达水平,CCK-8法检测增殖能力,划痕法检测细胞迁移能力;体外成脂诱导各组冷冻ASCs成脂分化,RT-PCR检测成脂关键基因PPAR-γ和CEBP-α的表达水平,分析其成脂分化潜能。（2）冷冻ASCs辅助脂肪移植动物实验:BALB/c裸鼠随机分为4组;将3个不同年龄组的1 × 106个冷冻ASCs分别与0.3 ml的脂肪颗粒混合后,注射于裸鼠背部脊柱两侧皮下;空白对照组:注射10 μl PBS与脂肪颗粒混合物。比较各组脂肪移植物的重量和体积,HE染色评估脂肪细胞的完整性和坏死组织所占比例,Perilipin免疫荧光染色分析移植物内脂肪细胞的存活情况,CD31免疫组织化学染色评价脂肪移植后新生血管密度。第二部分:不同供区部位脂肪来源干细胞深低温保存后生物学特性的比较（1）冷冻ASCs生物学特性检测:行吸脂术的健康志愿者,分别从上肢、腹部、髂腰部和大腿四个部位抽取吸脂肪组织20ml,采用胶原酶分离获得SVF,应用Muse细胞分析仪检测各部位的脂肪组织内SVF的产量和活力,流式细胞仪检测各部位SVF中脂肪来源干细胞的占比;ASCs体外培养,深低温保存4周。比较四个供区部位的ASCs冷冻后的生物学特性:MSC表面标记物表达水平;通过CCK-8法检测增殖能力,划痕法检测细胞迁移能力;体外成脂、成骨和成软骨诱导评估各吸脂部位ASCs深低温保存后的分化潜能,通过RT-PCR检测成脂关键基因PPAR-γ和CEBP-α,成骨关键基因ALP和OPN,成软骨关键基因COL2A1和COMP的表达水平。（2）冷冻ASCs辅助脂肪移植动物实验:将脂肪移植物与4个不同供区部位的冷冻ASCs共移植,皮下注射到裸鼠体内,4个实验组和1个空白对照组（n=10）,移植3个月后取材,比较各组脂肪移植物的重量和剩余体积,HE染色及组织学评价,分析各组移植物的脂肪细胞完整性、囊肿/空泡、炎性组织、纤维化程度;CD31免疫组化染色观察各组移植物的新生血管情况。第三部分:水动力技术和常规吸脂技术获取的脂肪来源干细胞深低温保存后生物学特性的比较（1）冷冻ASCs生物学特性检测:同一术者随机应用水动力辅助吸脂技术和常规负压吸脂技术分别在相对应的吸脂区域各抽取50ml脂肪组织,共20例。从脂肪组织中分离SVF,应用Muse细胞分析仪检测两组SVF的产量和活力,体外培养扩增脂肪来源干细胞,深低温保存4周。通过流式细胞仪检测两组冷冻ASCs的免疫表型,活/死细胞染色观察各组细胞形态,CCK-8法检测增殖能力,划痕法检测细胞迁移能力;体外成脂诱导比较两组冷冻ASCs成脂分化潜能,通过RT-PCR检测成脂关键基因PPAR-γ和CEBP-α的表达水平。（2）冷冻ASCs辅助脂肪移植动物实验:将脂肪移植物分别与两种吸脂技术的冷冻ASCs共移植于裸鼠背部,共2个实验组和1个空白对照组（n=10）。移植3个月后取材,比较3组移植物的重量和体积;石蜡切片经HE染色,Perilipin和Masson免疫组化染色,评价各组移植物内脂肪组织和纤维化组织的分布,CD31免疫组化染色观察各组移植物的新生血管情况。应用Western blot法检测移植物内膜联蛋白Annexin V的表达水平,比较各组细胞凋亡情况。研究结果第一部分:（1）各年龄组单位体积脂肪SVF的含量无显著性差异,SVF细胞活力随年龄增长呈下降趋势。各组冷冻ASCs的来源干细胞阳性表面标志物水平无差异。ASCs细胞增殖能力和迁移能力随年龄增长逐渐降低。体外成脂分化诱导结果显示油红O染色各年龄组的吸光度值无差异,并且成脂相关基因PPAR-γ和CEBP-α表达水平无明显差异。（2）ASCs辅助脂肪移植于裸鼠皮下后3个月,不同年龄组间移植物重量和剩余体积相比较,脂肪存活率随着年龄的增长逐渐下降。HE染色结果显示,各年龄组ASCs辅助移植脂肪可见脂肪细胞分布均匀,纤维结缔组织及坏死组织较少,各组间脂肪细胞完整性和坏死组织比例比较差异有统计学意义;不同年龄组间移植物内的脂肪细胞完整性和坏死组织占比差异无统计学意义;免疫荧光染色结果显示,各年龄组ASCs辅助脂肪移植组均可观察到较多的Perilipin阳性脂肪细胞,分布均匀。各年龄组新生血管密度相近,差异无统计学意义。第二部分:（1）大腿的脂肪组织分离的SVF计数和活力以及脂肪来源干细胞占比最高,其次是腹部;大腿部位的ASCs深低温保存后复苏率最高;供体部位不影响冷冻脂肪来源干细胞的细胞表型和形态;大腿部位深低温保存后脂肪来源干细胞深具有较高的细胞增殖和迁移能力,其次是腹部;上肢、腹部、髂腰部和大腿部的冷冻脂肪来源干细胞体外成脂诱导分化潜能相近;腹部和大腿部位的冷冻ASCs具有更好的成骨分化潜能;大腿部位冷冻ASCs的体外成软骨分化潜能优于其他部位。（2）腹部组和大腿组脂肪移植物存活率高于上肢组和髂腰组;腹部和大腿组的脂肪完整性显著高于上肢和髂腰组;腹部和大腿组的囊肿/空泡、炎性细胞浸润程度、纤维化程度显著低于上肢组和髂腰组;脂肪移植物CD31免疫组化染色,共移植组间新生血管计数无统计学差异。第三部分:（1）水动力技术采集的脂肪组织分离的SVF产量和细胞活力大于常规负压技术。两组ASCs深低温保存后的细胞形态及MSC标记物表达水平无明显差异,水动力组冷冻ASCs的细胞增殖能力和迁移能力高于常规组;水动力组冷冻ASCs具有更好的体外成脂诱导分化能力。（2）水动力组脂肪移植物存活率高于常规组,脂肪细胞完整性高于常规组,纤维化比例低于常规组,差异有统计学意义;水动力组移植物内血管密度明显高于常规组;水动力组脂肪移植物凋亡水平低于常规组。研究结论（1）人脂肪来源干细胞深低温保存后的细胞增殖和迁移能力随年龄的增长出现下降趋势,但年龄因素不影响冷冻ASCs的成脂分化潜能。不同年龄的人冷冻脂肪来源干细胞均有效地提高了裸鼠移植脂肪的存活率,年轻人群冷冻ASCs辅助脂肪移植的效果优于老年人群。（2）与上肢和腰部相比,大腿和腹部的冷冻ASCs具有更显著的细胞增殖、迁移能力和多向分化能力,大腿和腹部的脂肪来源干细胞经低温保存后仍保持了较好的生物学特性。大腿和腹部的冷冻脂肪来源干细胞辅助脂肪移植可获得更好的存活。（3）水动力辅助吸脂技术获取的脂肪来源干细胞经深低温保存后具有更好的生物学特性。其细胞增殖能力和迁移能力、体外成脂诱导分化能力、辅助脂肪移植的存活率均优于常规组。