[目的]本实验室长期从事磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidylinositol3-kinase, PI3K)信号转导通路中关于调节亚基PIK3R3功能的相关研究,前期研究证明PIK3R3在细胞多种病理生理下发挥重要作用,如在白血病细胞中阻断PIK3R3可抑制白血病细胞的增殖、促进其分化,PIK3R3可与视网膜母细胞瘤蛋白(retinoblastoma protein, RB)及细胞增殖核抗原(proliferation cell nuclear antigen, PCNA)相结合进而调控肿瘤细胞的增殖,而且PIK3R3可以通过非AKT依赖性途径激活NFκB信号通路,参与结直肠癌的血管生成。但PIK3R3作为P13K信号转导通路重要的调节亚基,是否参与脂质代谢,及在脂质代谢中的作用尚不明了。本部分研究旨在明确PIK3R3在肝脏脂质代谢中的作用。[方法]首先,我们利用既往文献报道的肝脏脂质代谢的动物模型,通过高脂饲料喂养造成小鼠的脂肪肝模型,以及饥饿再喂养模型,应用WB及QPCR分别检测小鼠肝脏中P13K各种不同催化亚基及调节亚基蛋白表达及mRNA水平的变化。然后,我们在高脂饮食脂肪肝模型的基础上,利用本实验室前期构建的PIK3R3过表达腺病毒及PIK3R3特异性的siRNA通过尾静脉注射入小鼠体内,观察上调或下调PIK3R3表达对于肝脏脂肪代谢的影响。最后在体外实验中,利用人正常肝细胞作为实验模型,通过转染PIK3R3过表达质粒及特异性的siRNA,观察干预PIK3R3的表达对正常肝细胞酮体生成的影响。[结果]我们通过高脂饮食喂养成功建立了小鼠的脂肪肝动物模型,表现为肝脏体积增大、重量增加,肝脏表面呈灰白色,HE染色可见肝小叶内散在分布空泡,油红O染色可见大量脂滴分布,这些均与既往文献报道的结果相一致。我们收集建模过程中不同时间段的小鼠肝脏,发现随着高脂饮食时间的延长,脂肪肝程度的加重,PIK3R3的mRNA水平及蛋白表达均逐渐降低,而P13K其他催化亚基和调节亚基并无明显变化。而在饥饿再喂养模型中,我们发现小鼠饥饿24小时后,PIK3R3的mRNA水平及蛋白表达明显增高,而饥饿后再给以饲料喂养24小时后,PIK3R3的mRNA水平及蛋白表达又恢复至本底水平,这提示PIK3R3可能参与肝脏脂肪代谢；而同时P13K其他催化亚基和调节亚基并无明显变化,提示PIK3R3可能区别于其他亚基,在脂肪代谢中有其独特的作用。进而,我们在高脂饮食的脂肪肝动物模型中干预PIK3R3的表达,发现过表达PIK3R3可缓解小鼠的脂肪肝表型,而沉默PIK3R3则加重了小鼠的脂肪肝。继而在体外细胞水平的实验结果也与小鼠体内实验相吻合,即PIK3R3对肝细胞酮体生成有显著的影响。[结论]高脂饮食及饥饿再喂养等饮食因素可影响PIK3R3的mRNA水平及蛋白表达,而对P13K其他催化亚基或调节亚基的影响不大,提示PIK3R3区别于其他亚基,在肝脏脂肪代谢中有其独特的作用；在小鼠的脂肪肝动物模型中干预PIK3R3的表达,可调控小鼠的脂肪肝表型,同时在人正常肝细胞中也可调控酮体生成能力,影响肝细胞的脂肪代谢。[目的]在前一部分研究中,我们利用高脂饮食的小鼠脂肪肝模型,发现PIK3R3可能参与肝脏脂肪代谢,干预PIK3R3的表达能够影响小鼠肝脏及人正常肝细胞的脂肪代谢,但PIK3R3调控脂肪代谢的机制尚不明确。过氧化物酶体增殖物激活受体家族(peroxisome proliferators-activated receptors, PPARs)作为一种配体激活型的核受体,在脂质代谢中起到关键的中枢调控作用,而其中的PPARa (PPARA)亚型主要表达于肝脏组织中,可调控多种代谢关键酶的表达,尤其对脂肪酸分解代谢产生影响,而我们前期实验观察到,PIK3R3可以调控ACADM及CPT1A的mRNA水平和蛋白表达,这两个关键酶亦受到PPARA的调控。因此,我们提出科学假设,PIK3R3是否依赖于PPARA调控肝脏脂肪代谢,本部分研究旨在阐明PIK3R3调控肝脏脂肪代谢的潜在机制。[方法]我们在人正常肝细胞L02及Chang liver中,通过转染PIK3R3过表达质粒及特异性的siRNA,干预PIK3R3的表达,利用WB及QPCR技术分别检测PPARA及PPARG两个基因蛋白表达及mRNA水平的变化。继而我们利用前一部分中高脂饮食及饥饿再喂养的动物模型样本,检测PPARA蛋白表达及mRNA水平的变化。进而利用第一部分中干预PIK3R3表达后小鼠的肝脏标本,通过免疫组织染色法、WB及QPCR检测其中PPARA蛋白表达及mRNA水平的变化。最后分别在体内及体外实验中干预PPARA的表达,观察其对PIK3R3调控脂肪代谢作用的影响。[结果]在人正常肝细胞L02及Chang liver过表达PIK3R3可明显促进PPARA的蛋白表达及mRNA水平,沉默PIK3R3可明显抑制PPARA的蛋白表达及mRNA水平,而对PPARG的蛋白表达及mRNA水平没有明显影响。利用论文第一部分实验中高脂饮食及饥饿再喂养的动物模型样本检测PPARA,发现PPARA的蛋白表达及mRNA水平随着高脂饮食时间的延长而逐渐降低,饥饿条件下小鼠肝脏内PPARA的蛋白表达及mRNA水平明显升高,而饥饿后再给以喂食可恢复至正常喂养时的水平,这提示PPARA的表达受到不同饮食条件的调节,并且与前文发现的PIK3R3受饮食条件调节的变化趋势一致。而在干预PIK3R3表达后,PPARA的表达随之变化;最后在干预PIK3R3的同时也干预PPARA的表达,可逆转PIK3R3对脂肪代谢的调控作用。[结论]PIK3R3可以调控人正常肝细胞及小鼠肝脏的脂肪分解代谢,而这种调控作用是通过调控PPARA这一脂质代谢关键转录因子的表达来实现的,干预PPARA的表达可逆转PIK3R3对脂肪代谢的调控作用。[目的]前面两部分研究表明PIK3R3可以调控肝脏脂肪代谢,并且其调控功能是依赖于对PPARa(PPARA)的表达来实现的,但PIK3R3调控PPARa的机制尚不明确,本部分内容旨在探索其中的具体分子机制。[方法]通过加入CHX(Cycloheximide,放线菌酮)或MG132(Proteasome抑制剂),分别抑制肝细胞的蛋白合成及蛋白降解,观察是否可以影响PIK3R3对PPARa蛋白表达的调控作用,从而明确PIK3R3是如何调控PPARa表达的。进而构建了PPARa的启动子荧光素酶质粒,观察PIK3R3对PPARa启动子活性的影响。既往文献报道PPARa的转录调控主要受到HNF4a(hepatic nuclear factor4a,肝核因子4a)及NR2F2(nuclear receptor subfamily2group F member2,核受体亚家族成员2F组2)两个转录因子的调节,我们通过QPCR及WB检测PIK3R3对这两个转录因子表达的影响。接下来我们利用肝细胞L02行染色质免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation, ChIP),应用QPCR及PCR产物琼脂糖电泳技术,观察过表达或沉默PIK3R3后HNF4a(HNF4A)结合于PPARa启动子能力的变化。我们在肝细胞L02中同时干预PIK3R3及HNF4A的表达,观察HNF4A是否可以介导及阻断PIK3R3对PPARa蛋白表达及mRNA水平的影响。在肝细胞中加入AKT抑制剂SH-6或转染AKT特异性的siRNA,观察PIK3R3调控HNF4A和PPARa是否依赖于经典的AKT信号通路。而既往研究表明PIK3R3可与BRGl (Brahma-related genel, Brahma相关基因1)结合并定位于细胞核内,BRG1是SWI/SNF染色质重塑复合物家族的一员,可以影响HNF4A的转录活性。因此我们通过蛋白免疫共沉淀(Co immunoprecipitation, Co-IP)及荧光共定位技术检测PIK3R3是否可以与BRGl相结合,利用ChIP技术检测BRG1是否结合于HNF4A的启动子区域,并且这种结合是否受到PIK3R3过表达或沉默的影响。最后在细胞中通过转染BRG1特异性siRNA沉默BRG1及利用BRG1突变的细胞系检测PIK3R3是否依赖BRG1调控HNF4A及PPARa的表达。[结果]肝细胞中加入MG132对PIK3R3调控PPARa蛋白表达的作用没有明显影响,而加入CHX可阻断PIK3R3对PPARa的调控作用；过表达PIK3R3可促进PPARa的启动子活性,而沉默PIK3R3可抑制PPARa的启动子活性。PIK3R3可调控HNF4A的mRNA水平及蛋白表达,但对NR2F2没有明显影响,而进一步PIK3R3可影响HNF4A结合于PPARa启动子的能力,干预HNF4A的表达可阻断PIK3R3对PPARa mRNA水平及蛋白表达的影响,AKT抑制剂及特异性siRNA不能阻断PIK3R3对HNF4A及PPARa的影响。Co-IP及荧光共定位实验证实PIK3R3与BRG1结合并浓聚于细胞核内,干预PIK3R3可影响BRG1与HNF4A启动子结合的能力。而在BRG1沉默或缺失的条件下,PIK3R3失去调控HNF4A及PPARa的能力。[结论]PIK3R3通过影响PPARa的转录调节其蛋白表达,PIK3R3调控PPARa依赖于HNF4A,但不依赖于经典的AKT信号通路。PIK3R3可与BRG1结合从而影响HNF4A的转录活性并调控PPARa的表达。[目的]前三部分的研究阐述了PIK3R3在肝脏脂肪代谢中的作用,提示PIK3R3可以通过调控PPARA的表达,从而影响正常肝脏细胞的脂肪分解代谢,而既往研究表明PIK3R3在包括卵巢癌、结肠癌、肝细胞癌等多种肿瘤中呈异常过表达,且PPARA因其可促进脂肪分解为细胞供能,可促进肿瘤细胞的增殖、抑制细胞凋亡,被认为具有癌基因的特征。我们前期的结果证实,在结肠癌中PIK3R3也可促进PPARA的表达,那么在肝癌中PIK3R3和PPARA两者的表达是否也存在一定的相关性,PIK3R3在肝癌中的作用是否也依赖于PPARA。本部分研究旨在明确在肝癌中,PIK3R3与PPARA的相关性,及PIK3R3调控肝癌细胞脂肪代谢的能力是否依赖于PPARA。[方法]我们通过在肝癌细胞HepG2及SMMC-7721中转染PIK3R3过表达质粒及特异性siRNA,干预PIK3R3的表达,进一步通过WB检测PPARA及PPARA上游转录因子HNF4A的蛋白表达水平,通过试剂盒法检测肝癌细胞培养基上清中酮体的含量,观察在肝癌细胞中PIK3R3是否可以调控PPARA的表达,及PIK3R3对脂肪代谢的影响。进而我们利用CCK8法及BrdUPI双掺入法检测肝癌细胞的增殖及DNA合成速度,观察干预PIK3R3的表达是否可以调控肝癌细胞的增殖,我们同时还应用既往构建的PIK3R3过表达及沉默慢病毒,感染肝癌细胞,药物筛选得到PIK3R3稳定过表达及沉默的细胞株,利用该稳定细胞株行软琼脂克隆形成实验、平板克隆形成实验及细胞迁移、侵袭实验,观察PIK3R3对克隆生长及侵袭转移。继而我们在干预PIK3R3表达的基础上,同时干预PPARA的表达,观察肝癌细胞脂肪代谢水平的变化、细胞增殖能力及迁移能力,从而明确PIK3R3调控肝癌细胞脂肪代谢及细胞增殖是否依赖于PPARA。最后我们在肝癌细胞及临床肝癌标本中检测PIK3R3及PPARA表达的相关性。[结果]在两株肝癌细胞HepG2及SMMC-7721中干预PIK3R3的表达,可引起HNF4A及PPARA蛋白表达水平的变化,即过表达PIK3R3可促进HNF4A及PPARA的表达,而沉默PIK3R3可抑制HNF4A及PPARA的蛋白水平；同时干预PIK3R3可影响肝癌细胞培养基上清中的酮体含量,且与正常肝细胞LO2、 Chang liver中的结果相一致。我们同时也观察到,过表达PIK3R3可促进肝癌细胞的增殖及侵袭迁移,表现为CCK8实验中细胞吸收值的升高、BrdUPI实验中细胞处于DNA合成期的比例增高,软琼脂克隆形成实验和平板克隆形成实验中表现为生成克隆的数目增多、克隆体积增大,以及穿过小室的细胞增多,细胞运动速度加快。而干预PIK3R3的同时干预PPARA,可部分逆转PIK3R3对肝癌细胞生成酮体及细胞增殖的影响,但对PIK3R3促进肝癌细胞迁移的作用没有显著影响。在肝癌细胞系及临床肝癌标本中PIK3R3与PPARA的表达具有一定相关性。[结论]PIK3R3与PPARA表达水平的相关性及PIK3R3可以调控PPARA表达水平的现象,不只限于正常肝细胞中,在肝癌细胞及临床肝癌标本中也同样存在。PIK3R3调控肝癌细胞脂肪代谢及增殖的能力可被PPARA部分阻断,提示PIK3R3促进肿瘤发生发展的作用有可能与其调控脂质代谢相关。