脓毒症(Sepsis)是指各种致病微生物或其毒素存在于血液或组织中,是机体对感染的一种全身性炎症反应(SIR),表现为不能控制的炎症反应,是严重感染、重度创伤、大手术后,重型急性胰腺炎和休克等常见的并发症。其继续发展则可以导致全身炎症反应综合征(SIRS)、脓毒症和多器官功能障碍综合征(MODS)。脓毒症时由于炎性细胞因子的瀑布样释放,激活了凝血系统,同时纤溶系统及生理性的抗凝系统受到不同程度的抑制,血液处于高凝状态,微血管内微血栓广泛形成,导致微循环障碍,脓毒症进一步发展为严重脓毒症及脓毒症休克。脓毒症时内皮细胞活化表达组织因子(tissue factor,TF)增加进而激活外源性凝血系统；另外血小板活化、聚集形成病理性血栓,这在炎症和凝血之间复杂的相互作用中也占据着非常重要的中间位置。一氧化碳(carbon monoxide, CO)在机体内由血红素加氧酶(HO)催化血红素产生,CO过去曾被认为是破坏细胞呼吸作用的有害物质。近年来的研究发现CO是一种气体信号分子的,在离体和在体模型中对由内毒素诱导产生的各种细胞因子具有显著的抑制作用,我们前期研究也发现CO可以有效地缓解急性炎症反应,表现出重要的细胞保护作用和抗炎效用,但其机制尚未完全明确。近来,一种新合成的新型金属---羰基化合物,一氧化碳释放分子(tricarbonyldichlororuthenium (Ⅱ) dimer, CORM-2)被证实可以在机体内缓慢释放CO,扩张主动脉,降低心肌缺血再灌注损伤,具有潜在的药用价值。而目前,有关外源性CO对脓毒症高凝状态的影响的相关研究还比较少。为此,在本研究中,我们通过建立人脐静脉内皮细胞(HUVEC)模型及小鼠CLP脓毒症模型,并用CORM-2干预,进行离体和在体实验研究,旨在探讨外源性CO是否对脓毒症早期高凝状态具有抑制作用,并探讨CO可能的作用机制。第一部分外源性一氧化碳释放分子(CORM)2对LPS刺激HUVEC后组织因子(TF)表达的抑制作用及(部分)分子机制目的1、选用新生儿脐带作为内皮细胞来源建立HUVEC模型并验证；2、建立HUVEC脓毒症模型并确定最佳LPS刺激浓度；3、确定CORM-2的最佳实验浓度；4、检测CORM-2对LPS诱导HUVEC后TF及NF-κB活性的影响。方法HUVEC来源于6小时内新生胎儿脐带,宜在37℃,含5%CO2、95%湿度的环境中培养,采用M199培养基,定期换液,6-8天细胞生长达融合后用胰蛋白酶消化,按1：3的比例传代。观察HUVEC的形态,检验细胞内Ⅷ因子相关抗原表达。再取传代后生长达到融合的HUVEC,弃去细胞培养基,加入1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml不同浓度LPS对HUVEC进行刺激,培养箱培养4h,观察炎症反应中多种细胞因子的变化,选定最适LPS浓度。运用10μM、50μM、100μM、200gM不同浓度的CORM-2与HUVEC共孵育4h,培养箱条件均为37℃、5%CO2和95%相对湿度,观察CORM-2的细胞毒性和确定实验浓度。酶联免疫吸附试验(ELISA)及凝胶电泳迁移率改变分析法(EMSA)检测CORM-2应用前后HUVEC脓毒症模型TF活性、含量及NF-κB表达的情况。结果本实验室成功建立了HUVEC模型,模型细胞生长融合后呈典型的铺路石状排列,细胞内Ⅷ因子相关抗原阳性率达95%。HUVEC脓毒症模型取10μg/ml LPS为最适浓度,建立过程规范,损伤后PMN粘附率明显增高,NO、ROS活性明显增加,iNOS、ICAM-1、HO-1蛋白的表达明显增加,NF-κB活性也显著增高。10μM、50μM、100μM浓度对HUVEC进行刺激效果较好,相比LPS组,CORM-2与LPS共同处理组对TF及NF-κB表达有明显的抑制作用。结论本实验室培养的HUVEC及相应的脓毒症模型符合实验要求,可以用于体外实验。HUVEC的脓毒症模型可以用于在细胞水平研究炎症的反应机制,各种炎症因子、黏附分子、转录因子等都发生了相应的变化。本课题研究表明,外源性CO不但可以抑制炎症反应,对TF及NF-κB表达亦有明显的抑制作用。这一结果表明,外源性CO可以通过干预外源性凝血途径来抑制脓毒症的发展,对于临床危重病人的救治具有十分重要的意义。第二部分外源性一氧化碳释放分子(CORM)2对CLP小鼠TF的抑制作用及(部分)分子机制目的为了探讨机体脓毒症时的凝血系统的变化,我们建立了CLP小鼠的在体模型,并通过检测小鼠脓毒症后肝脏炎症反应程度,确保CLP模型建立的质量,并进一步明确严重脓毒症小鼠血液中TF与HUVEC脓毒症模型中TF表达的关系,同时重点探讨外源性CO对机体严重脓毒症后外源性凝血途径的抑制作用及部分分子机制。方法6-8w大小的小鼠正常饲养1W后,2%异氟烷麻醉进行盲肠结扎穿刺法建立小鼠脓毒症模型,经病理检测和生命体征、细胞因子、黏附分子、转录因子及参与炎症反应放大与延续的多种酶等指标确定模型的标准化。小鼠在CLP后立即静脉注射CORM-2(8.0mg/kg)(加入在152μl生理盐水中),以假手术组小鼠为对照组。用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测CORM-2应用前后各时间段脓毒症小鼠血浆中TF、TFPI含量表达的变化。结果小鼠脓毒症模型的建立过程规范,操作简单,且模型的检测指标明确。CLP术后24h小鼠肝细胞明显肿胀,肝小叶结构紊乱；肝功能损害较重,血清中ALT含量升高；多种细胞因子及粘附分子表达明显增加,AP-1、NF-κB蛋白表达明显增加,脓毒症模型达到了实验要求。外源性凝血系统启动因子TF表达亦明显增加而TFPI表达则减低。予CORM-2抑制炎症反应发展的同时,可抑制TF、促进TFPI的表达。结论本CLP小鼠脓毒症模型在机体损伤,肝脏损伤方面达到了预期的要求。本课题研究显示,外源性CO的干预能明显抑制外源性凝血系统启动因子TF表达,同时促进TF的拮抗因子TFPI的表达。因NF-κB可介导多种炎症因子及TF的基因转录,而CORM-2可以抑制NF-κB蛋白表达这在第一部分的离体研究中已阐述,这一结果提示外源性CO至少部分是通过抑制NF-κB的活性来干预外源性凝血系统的启动。第三部分高氧预处理联合外源性一氧化碳释放分子(CORM)2对CLP小鼠血小板膜糖蛋白及血小板功能的调节作用目的1、检测高浓度氧与CORM-2联合干预下CLP小鼠凝血因子的变化；2、探讨高氧与CORM-2联合干预下CLP小鼠血小板膜糖蛋白及血小板功能指标的变化。方法先使小鼠处于纯氧环境中0.5小时作为预处理,再行CLP处理及CORM-2干预。对不同时间段处理组小鼠先以双波长吸光度比值法检测血液中碳氧血红蛋白浓度(HBCO%),并计算其存活率；再取全血检测凝血因子FIB、D-D水平；分离富血小板血浆(PRP),用流式细胞仪分析PRP中血小板膜糖蛋白CD41、CD61、CD62-p水平,以检测脓毒症时血小板活化程度；最后取抗凝血,用玻球法分析血小板粘附率,用血小板聚集仪分析血小板聚集功能的变化,并制出聚集率曲线图,从功能上分析高氧联合CORM-2对CLP小鼠血小板的作用。结果高氧联合CORM-2干预CLP脓毒症小鼠后可以明显降低血液中HBCO的含量,并有效提高CLP小鼠的存活率；联合干预亦可降低凝血因子FIB、D-D的表达；同时降低血浆中血小板膜糖蛋白CD61、CD62p(CD41变化不太明显),对活化后血小板粘附和聚集功能的亢进也有明显的抑制作用。结论本研究采用高氧联合CORM-2对CLP小鼠进行干预,比单用CORM-2能更好地发挥外源性CO的作用。同时,从凝血因子、血小板活化及其功能指标的检测上也显示了高氧联合CORM-2可以在一定程度上抑制脓毒症时凝血系统的活化,为脓毒症的治疗扩展了新思路。