前言：创伤性脑损伤(Traumatic Brain Injury,TBI)是指由外伤引起的脑组织损伤。致残率高、死亡率高,是儿童和青少年致残的主要原因之一。随着现代医疗技术的不断发展,对TBI的治疗已经取得了很大的进展。然而,临床上治疗TBI失败的主要原因可能是由原发损伤引起的继发损伤,包括炎性反应、血脑屏障破坏和一系列的细胞因子释放等。目前,治疗严重的脑损伤即使挽救了生命,但因为已经坏死的神经细胞无法再生恢复,因此仍缺乏有效的治疗措施来恢复患者由损伤引起的各种功能缺陷,给家庭与社会造成巨大的经济负担和精神负担。　　 神经干细胞(Neural stem cells,NSCs)或神经前体细胞(neural progenitorcells,NPCs)的特征和成功分离培养使直接移植这些细胞治疗脑损伤成为可能。研究表明,在发育期胚胎和成年哺乳类动物的中枢神经系统中存在着具有多向分化潜能的NSCs。实验研究证明,NSCs移植中枢神经系统损伤性疾病后可以在一定时间内存活,并且分化成神经元和神经胶质细胞,通过NSCs移植替代治疗可能实现修复中枢神经系统损伤或疾病引起的组织损伤并部分恢复由损伤引起的功能缺陷。然而,中枢神经系统(Central Neural System,CNS)外源性损伤引起的局部生物化学改变及神经细胞相对较弱的再生能力限制了移植NSCs的存活和分化。如何有效地解决构建NSCs自我更新、有序增殖与定向分化为神经元所赖生存的微小环境,提高移植后细胞长期存活及神经网络的建立,成为目前研究脑损伤NSCs代替治疗的热点。NSCs除了神经替代作用外,很多学者还把NSCs作为理想的靶细胞,用于体外转导进行基因修饰,然后对神经系统疾病进行体内移植治疗。　　 脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor,BDNF),是神经生长因子家族的重要成员,在中枢神经系统神经元的发育、存活、分化和轴突再生中发挥着重要作用。以前的研究表明,BDNF直接注入脊索损伤红核附近能够防止和逆转神经细胞萎缩,促进轴突再生,但此种给药途径限制了给药量,并且反复给药容易引起炎症和局部组织损伤。近年来,基因治疗得到了广泛研究。基因治疗是将正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用,从而达到治疗疾病的生物医学技术。基因治疗为应用BDNF治疗中枢神经系统疾病带来新的曙光。　　 因此,本研究应用基因转染技术将BDNF导入NSCs,采用PKH26荧光示踪剂分别标记这些细胞和天然的NSCs,并移植入TBI大鼠脑内。我们追踪观察了BDNF对NSCs的存活和分化的影响,并通过对损伤脑组织中突触蛋白的检测探讨了其促进功能恢复的可能机制。　　 方法：从E14大鼠胚胎分离NSCs,进行原代培养及传代培养;用含10％胎牛血清的培养基对NSCs进行诱导分化;采用免疫细胞化学技术对培养的NSCs和其分化为神经元的表型进行鉴定。采用改良的Feeney法制各创伤性脑损伤模型。PKH26荧光示踪剂标记NSCs,利用脑立体定位仪和微量注射泵进行NSCs脑内移植,应用荧光显微镜观察移植细胞的存活、分布和分化为βⅢ-微管蛋白阳性神经元的表型。构建真核表达载体pcDNA-BDNF,采用非脂质体的脂类转染试剂转染NSCs,应用免疫荧光双标、激光共聚焦扫描显微镜和RT-PCR技术检测转染细胞BDNF和Nestin的表达和共存。分别将BDNF转染的NSCs(BDNF/NSCs)和天然NSCs移植于TBI动物脑内,采用gridwalk和latency试验检测动物的神经行为学改变;观察BDNF对NSCs存活和分化的影响;采用免疫组织化学技术、免疫印迹技术和RT-PCR技术检测在不同移植组、移植后不同时间点脑组织损伤区BDNF、突触素(synaptophysin,SYP)和突触后蛋白(Shank2)mRNA和蛋白表达的改变。　　 结果：　　 1、在培养基中,NSCs呈球团状悬浮生长,Nestin表达阳性。用含10％胎牛血清的培养基对NSCs进行体外诱导分化,发现分化后第2天,多数细胞伸出突起,以后突起逐渐延长,分支增加。分化后第5d,部分细胞呈βⅢ-微管蛋白阳性。　　 2、PKH26标记的NSCs移植于脑内第8w,PKH26荧光强度未见明显减弱。第8w,细胞存活数量为4.1％±0.9％。在移植后第2w,一些细胞广泛迁移至移植核心以外区域。NSCs于移植后第1、2、4和8w分化为βⅢ-微管蛋白阳性神经元细胞的比例分别为4.3％±1.9％,8.1％±2.8％,13.6％±2.0％,11.4％±1.6％。　　 3、克隆测序结果显示,重组质粒与参考序列完成一致,pcDNA3.1-BDNF质粒经HindⅢ/EcoRⅠ双酶切,琼脂糖凝胶电泳可见749bp和5.4kb两个条带,其大小分别与载体pcDNA3.1和BDNF cDNA一致。转染细胞经药物筛选后第10d,免疫细胞化学染色显示部分细胞呈Nestin及BDNF双重阳性,RT-PCR检测可见转染细胞中BDNF呈高表达。　　 4、与NSCs移植组比较,在移植后第1w,BDNF/NSCs移植组大鼠通过平板的移动时间明显缩短(p＜0.05)。Gridwalk试验中,在移植后第1w,BDNF/NSCs移植组前、后肢不对称分值均明显低于NSCs移植组(p＜0.05).在第2w,两组间后肢的不对称分值也有显著性差异(p＜0.05),但此时BDNF/NSCs移植组的后肢表现已经恢复至基线水平。　　 5、在移植后的不同时间点,与NSCs移植组比较,BDNF/NSCs组的移植细胞存活数和分化为神经元的比例均明显增加(p＜0.05)。　　 6、RT-PCR检测发现,在移植后第1、2w,BDNF/NSCs移植组损伤灶及周围脑组织中的BDNF呈高表达。　　 7、在移植后第1、2w,BDNF/NSCs移植组损伤灶及周围组织中的SYP和Shank2的基因和蛋白表达均高于NSCs移植组(p＜0.05),第4、8w,Shank2的基因和蛋白表达也高于NSCs组(p＜0.05)。　　 结论：　　 1、PKH26标记NSCs,准确性高、标记率高、方法简便、未见明显毒性,PKH26标记的NSCs移植于TBI大鼠损害区,移植后第8w,PKH26荧光强度未见明显减弱,能够很好的示踪观察移植细胞的存活、迁移和分化。提示PKH26可以作为一种有效的体内示踪剂对NSCs移植治疗TBI进行示踪观察。　　 2、外源基因BDNF通过非脂质体的脂类转染试剂转染NSCs,在一定时间内,可以使NSCs持续、稳定地表达BDNF。　　 3、BDNF/NSCs移植促进了TBI动物的感觉运动功能恢复。　　 4、BDNF/NSCs移植TBI更有利于这些移植细胞的存活和提高移植细胞分化为神经元的比例。　　 5、在BDNF/NSCs移植治疗TBI中,BDNF高表达促进了神经生长、突触素和突触后蛋白的表达。这可能是BDNF/NSCs移植TBI促进感觉运动功能恢复的机理之一。